简介:目的探讨雌激素受体α(ERα)基因敲除小鼠的优化繁育方法及ERα基因敲除小鼠子代鼠的鉴定方法,建立ERα基因敲除小鼠模型,为进一步研究ERα蛋白的功能奠定基础。方法用4种不同的交配方式观察子代鼠的各表型比率及雌、雄性ERα基因突变纯合子小鼠的繁殖能力;从子鼠鼠尾中提取基因组DNA,用PCR方法扩增ERα基因片段,琼脂糖凝胶电泳后观察结果。HE染色观察雌、雄性ERα^-/-小鼠生殖系统表型变化。结果WT、ERα^+/-、ERα^-/-各表型小鼠互交繁殖结果基本符合孟德尔遗传规律,且雌、雄性ERα^-/-小鼠无繁殖能力。与WT比较,雄性ERα^-/-小鼠睾丸脏器系数降低,睾丸病理变化表现为生精小管管腔膨胀,生精细胞层变薄,且排列不规则;雌性ERα^-/-小鼠子宫脏器系数降低,子宫和卵巢病变明显,表现为:子宫浆膜、肌层、内膜层细胞排列不规则,卵巢有囊性病变、充血,无黄体。结论雌、雄性ERα^+/-小鼠交配是繁育ERα^-/-小鼠的较好方法;实验所用PCR方法能够精确鉴定ERα^-/-小鼠,ERα^-/-小鼠的获得为ERα蛋白功能的实验研究提供了较理想的动物模型。
简介:目的使用RNA-Seq技术分析Miif-m敲除鼠与野生鼠的血管纹转录组,研究Mitf-m基因敲除后的差异表达基因及相关改变的分子机制。方法分别取Miif-m敲除鼠(Mitfmi-△M/mi-△M;MM组)与野生鼠(Miif-m+/+;ww组)的血管纹进行总RNA提取;制备cDNA文库,用IlluminaHiSeq2000测序系统行高通量测序。利用软件Tophat2.2.0将cleanreads比对到参考基因组;分别用软件RSeQS-2.3.2和cufflinks来检测测序结果的均一性和基因表达水平。使用edgeR和DESeq程序筛选差异表达基因(differentialexpressedgenes,DEGs);选择下调DEGs,用KOBAS2.O进行基因本体(geneontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes,KEGG)代谢途径的富集分析。结果MM组与WW组在参考基因组上mapping的cleanreads数分别为42463888和39718542,分别有88.7%和87.4%的reads是唯一映射,说明RNA-Seq结果可靠。DEGs筛查结果表明,相对于WW组,Mftf-m敲除鼠血管纹有45个DEGs,上调表达基因有7个,下调表达基因有38个。GO富集分析发现下调表达基因与黑色素的合成和代谢过程、色素沉着有关,值得关注的是与内向整流钾离子通道Kcnj10和Kcnj13相关。KEGG富集分析显示下调表达基因主要富集于黑色素生成通路。结论RNA-Seq分析拓展了Mftf-m基因调控网,为探究Mitf-m突变所致听力-色素综合征的分子机制及特异性研究Mitf不同转录子的功能奠定了基础。
简介:摘要目的探讨Cfap65基因敲除对小鼠精子发生的影响。方法利用CRISPR/Cas9技术构建Cfap65基因敲除小鼠;使用PCR和Sanger测序方法进行小鼠基因型鉴定;依据小鼠基因型将小鼠分为Cfap65-/-组(n=3)与野生型组(n=3);生育力试验评估小鼠生育力;使用HE染色、免疫荧光、透射电子显微镜观察小鼠附睾精子与睾丸精子形态;使用定量实时聚合酶链锁反应检测Cfap65 mRNA在小鼠心、肝、脾、肺、肾和睾丸组织中的表达。结果Cfap65-/-组小鼠表现为完全不育,附睾精子数量减少和活动率低下,形态观察可见精子出现短尾、卷尾和尾部缺失,头部畸形率也显著高于野生型小鼠(1.67%±0.44%比33.00%±1.53%),差异有统计学意义(P<0.001)。Cfap65基因敲除导致小鼠精子领结构异常。Cfap65高表达于成年小鼠的睾丸、肺中;Cfap65在小鼠睾丸中的表达从4周龄到6周龄有一个急剧的增加(901.90±33.19比2 144.00±22.92),差异有统计学意义(P<0.001)。结论Cfap65表达具有组织特异性,缺失后导致雄性小鼠精子发生障碍,这可能与精子领运输障碍有关。
简介:摘要目的探讨Fmr1基因敲除型小鼠粪便肠道细菌群落的结构及多样性。方法利用16S rRNA高通量测序技术对10份小鼠粪便样本进行测序分析并进行生物学分析。结果两组样本测序共获得高质量序列325 280条,核心菌门为拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门。Anosim分析表明基因敲除(KO)组与正常野生型(WT)组小鼠两组间具有显著差异,组内样品重复性满足数据分析要求,Adonis分析表明本次检验可信度高(P<0.05)。LDA值展现KO组与WT组小鼠肠道微生态菌群有明显差异,基于Unifrac距离,Amova分析表明KO和WT组组间差异显著(P<0.05)。结论KO组与WT组小鼠肠道微生物群落的结构及多样性存在显著差异且具有统计学意义,提示孤独症与肠道微生态系统密切相关,肠道微生态系统可能通过微生物代谢的间接作用影响孤独症的发生发展,但具体的作用机制仍需进一步的研究。
简介:目的构建白念珠菌CaCSC1基因的基因缺失株,并初步探究它的功能。方法设计长引物,通过PCR直接扩增出带有SAT1flipper的CaCSC1基因敲除盒,转化到野生型白念珠菌菌株CAI4,并通过PCR鉴定出基因型正确的转化子,得到CaCSC1的基因缺失株。最后,通过倍比稀释的方法进行表型筛选。结果成功得到CaCSC1基因的缺失菌株。基因缺失菌株对酮康唑(Ketoconazole)敏感,对Zn2+、Mn2+和荧光增白剂(Calcofluorwhite)表现出耐受性。结论CaCsc1蛋白参与对锌离子和锰离子的稳态调控,和细胞膜和细胞壁的完整性也相关。
简介:目的探讨小剂量地塞米松对生长期小鼠骨密度及骨微结构的影响及其与OPG途径的关系。方法20只4周龄OPG^-/-雌性小鼠及20只野生型小鼠随机分四组(n=10):野生型安慰剂组(WT+saline),野生型地塞米松干预组(WT+DEX,地塞米松1mg/kg体重,肌肉注射,每周3次),OPG^-/-敲除小鼠安慰剂组(OPG^-/-+saline),OPG^-/-敲除小鼠DEX干预组(OPG^-/-+DEX,地塞米松1mg/kg体重,肌肉注射,每周3次)。6周后处死小鼠,一侧胫骨行显微CT扫描分析。结果OPG^-/-组的组织骨密度、骨小梁体积分数、骨小梁数量、骨小梁厚度均较其他三组降低(P〈0.05)。OPG^-/-+DEX组的组织骨密度、骨小梁体积分数、骨小梁数量、骨小梁厚度均较WT及WT+DEX组降低(P〈0.05)。OPG^-/-组的骨小梁模型因子及骨小梁分离度均较其他三组增加(P〈0.05);OPG^-/-+DEX组的骨小梁模型因子及骨小梁分离度均较WT及WT+DEX组增加(P〈0.05)。WT及WT+DEX组之间骨小梁微结构参数均无统计学差异。结论在生长期小鼠OPG基因功能缺失时,地塞米松有部分拮抗骨量丢失的作用,表明除了OPG/RANKL途径,地塞米松对骨代谢的影响是多途径的。
简介:β-胡萝卜素-15,15'-加氧酶(β-carotene-15,15'-momoxygenase1,bco1)是β-胡萝卜素转化成维生素A过程中的关键酶,bco1与bco1l是编码此酶的主要基因。本实验利用CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼的与β-胡萝卜素-15,15'-加氧酶编码相关的基因bco1与bco1l,以便深入开展对斑马鱼bco1的功能研究。分别在斑马鱼bco1与bco1l基因2号外显子选取sgRNA识别位点,体外转录制备sgRNA并与Cas9mRNA混合对斑马鱼Ⅰ细胞期受精卵进行显微注射,24h后收集部分胚胎进行PCR检测并将PCR产物进行单克隆测序确定sgRNA的有效性,构建首建鱼,并在此基础上通过PCR检测、凝胶电泳及测序筛选可遗传突变体。本研究分别获得了bco1基因突变与bco1l基因突变,分析表明这些缺失和插入均可导致编码序列的移码,为研究鱼类胡萝卜素代谢及相关发育过程等后续研究提供了材料。
简介:目的构建用于白念珠菌MXR1基因敲除的载体质粒,并通过Ura-Blaster策略敲除MXR1两条等位基因。方法分别扩增白念珠菌MXR1基因ORF两侧上下游的片段,通过酶切与连接反应,将上下游片段分别插入到p5921质粒的hisG-URA3-hisG盒两端,从而形成MXR1敲除载体质粒pUC-MXR1-URA3。通过Ura-Blaster策略将载体质粒转染到白念珠菌RM1000内,并采用PCR和Southern-blot杂交方法鉴定各步转染、复筛所得的阳性克隆。结果成功获得MXR1基因缺失的菌株。结论MXR1基因缺失菌株的构建,有助于深入研究白念珠菌耐药机制。
简介:摘要目的构建Spink5基因条件性敲除小鼠模型并鉴定其表型。方法采用CRISPR/Cas9技术构建基因型为Mb1cre/+Spink5floxp/floxp的B淋巴细胞Spink5基因条件性敲除小鼠(敲除组),以基因型为Mb1+/+Spink5floxp/floxp的小鼠为对照组。提取小鼠脾脏单个核细胞并经流式细胞荧光技术分选B淋巴细胞及非B淋巴细胞,然后分别进行基因型鉴定及淋巴上皮Kazal型抑制物(LEKTI)蛋白表达的测定。切取小鼠皮肤行HE染色,测量表皮厚度,免疫荧光染色测定小鼠皮肤LEKTI蛋白荧光强度。组间比较采用配对t检验或两独立样本t检验。结果基因型鉴定结果表明,成功构建稳定的B淋巴细胞Spink5基因条件性敲除小鼠模型。Western印迹显示,条件性敲除小鼠B淋巴细胞中LEKTI蛋白相对表达量为0.01 ± 0.02,显著低于非B淋巴细胞(0.66 ± 0.11,t = 9.99,P < 0.001)及对照组小鼠B淋巴细胞(1.08 ± 0.13,t = 13.78,P < 0.001)。39只敲除组小鼠中,4只出现皮肤干燥、散在鳞屑性肥厚型斑丘疹。敲除组皮损部位表皮厚度为(90.42 ± 21.31)μm,显著高于其非皮损部位[(29.71 ± 3.63)μm,t = 5.05,P = 0.002]及对照组表皮[(12.42 ± 2.21)μm,t = 6.74,P < 0.001]。免疫荧光检测显示,敲除组皮损处LEKTI蛋白荧光强度为46.21 ± 1.21,非皮损处为46.62 ± 2.13,与对照组(47.69 ± 1.71)差异均无统计学意义(P > 0.05)。结论成功构建了B淋巴细胞Spink5基因条件性敲除小鼠模型,为进一步探究Netherton综合征皮肤屏障缺陷伴免疫功能异常的机制提供研究基础。