简介:摘要目的比较脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)对多能干细胞诱导的人源心肌细胞(human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes,hiPS-CMs)及原代新生大鼠心肌细胞(cardiomyocytes,CMs)的影响。方法不同浓度LPS处理hiPS-CMs和原代新生大鼠CMs 24 ~ 48 h,通过实时无标记细胞分析技术(xCELLigence Real-Time Cell Analyser Cardio system RTCA) 观察hiPS-CMs和原代新生大鼠CMs的电生理变化;qRT-PCR方法检测NPPB mRNA表达水平和qPCR阵列法检测炎性基因表达水平。结果不同浓度LPS刺激后,原代新生大鼠CMs的电生理变化为搏动频率增加和搏动幅度减少(P<0.01),NPPB mRNA表达水平增加(P<0.01)。在hiPS-CMs中,相对应的LPS浓度刺激未能引起搏动幅度和搏动频率显著变化(P>0.05),NPPB mRNA表达水平未显著增加(P>0.05)。进一步增加浓度(2.5 μg/mL~40 μg/mL),hiPS-CMs的搏动幅度和搏动频率仍未发生明显变化(P>0.05),NPPB mRNA在高浓度LPS(5 μg/mL~40 μg/mL)发生差异性改变(P<0.01)。最后,在炎症相关基因表达方面,原代新生大鼠CMs表现为C3、Gpnmb、Atf3、Il6r和Ly96基因水平上调至1.5倍,hiPS-CMs表现为AK4、TOLLIP、SPP1、FABP1、IL6R、LY96和C3基因水平上调至1.5倍。结论与原代新生大鼠CMs相比,hiPS-CMs受到LPS的损伤明显减轻,表现出不同的炎症基因表达模式。
简介:研究了5-AZA、AngII及其联合诱导人心脏干细胞向心肌细胞分化和提高分化率的方法。经患者或家属同意,从心外科手术中获取人心脏右心耳组织,Ⅱ型胶原酶消化、培养、传代,选用P2-P8细胞与心脏干细胞抗体CD117(c-kit)结合后,经流式细胞仪无菌分选纯化心脏干细胞,对分选纯化后的c-kit+CSCs进行培养(见前期试验)。选取无菌分选纯化后c-kit+CSCs进行诱导、分化实验。实验随机分为四组:对照组(普通心脏干细胞培养液)、5-AZA诱导组、AngII诱导组、5-AZA和AngII联合诱导组。4周后用WesternBlotting测定心肌细胞特异性蛋白cTnI、Cx43的表达;用流式细胞仪测定各组心肌细胞分化率。人心脏干细胞诱导4周后,Westernblotting结果显示,四组均有cTnI、Cx43表达,对照组表达最弱,5-AZA和AngII联合组表达最强。人心脏干细胞诱导4周后流式细胞仪测定各组心肌细胞分化率,统计结果显示:对照组(27.86±4.52)%、5-AZA组(52.71±7.40)%、AngII组(40.48±7.02)%、5-AZA和AngII联合组(64.74±6.11)%;四组间均有统计学差异(P〈0.05)。5-AZA、AngII均能诱导人c-kit+CSCs分化为心肌细胞,5-AZA和AngII联合诱导的心肌细胞分化率高于5-AZA、AngII单独诱导方案。
简介:目的:探讨新生大鼠心肌细胞的分离和培养方法。方法:应用0.0625%的胰蛋白酶重复消化出生第2d乳鼠的心肌组织多次,收集的细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基中和,用差速贴壁分离法分离.在以溴脱氧尿嘧啶(Brdu)纯化心肌细胞后置CO2培养箱孵育7d。结果:分离1只乳鼠获得的心肌细胞产量约为140万个,且有活力心肌细胞占90%以上;培养4~6h的乳鼠心肌细胞开始贴壁生长,12~24h明显增殖,3~4d后细胞融合成片;心肌细胞由圆形变为梭形、星形、多角形。并出现自发性节律性搏动。结论:本研究应用的心肌细胞原代培养方法可获得高产量、高活力的心肌细胞,是一种可靠的心肌细胞培养方法。
简介:摘要目的探讨骨骼肌细胞Syncytin-1过表达对脊髓前角运动神经元-骨骼肌细胞-施万细胞共培养模型炎性因子、钠离子依赖性中性氨基酸转运体1(ASCT1)和神经保护因子的影响。方法(1)体外原代培养脊髓前角运动神经元、骨骼肌细胞、施万细胞,免疫荧光染色分别检测细胞胆碱乙酰转移酶(ChAT)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、钙结合蛋白B(S100B)的表达进行鉴定。(2)将Syncytin-1重组质粒及空载质粒分别转染骨骼肌细胞后24 h,与另外2种细胞混合,分别建立3种细胞的共培养模型(Syncytin-1重组质粒转染组:Syncytin-1重组质粒转染的骨骼肌细胞、脊髓前角运动神经元、施万细胞混合;空载质粒转染组:空载质粒转染的骨骼肌细胞、脊髓前角运动神经元、施万细胞混合)。于倒置显微镜下观察共培养细胞形态及连接的变化。共培养48 h后应用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测2组共培养细胞上清液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、血管内皮生长因子(VEGF)的浓度,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blotting分别检测2组共培养细胞Syncytin-1、ASCT1、TNF-α、iNOS、VEGF mRNA和蛋白的表达。结果(1)免疫荧光染色检测显示:脊髓前角运动神经元中ChAT阳性表达细胞、骨骼肌细胞中α-SMA阳性表达细胞、施万细胞中S100B阳性表达细胞均占95%以上,且定位在细胞质内。(2)Syncytin-1重组质粒转染组及空载质粒转染组共培养细胞的数量及形态未见明显差异。与空载质粒转染组比较,Syncytin-1重组质粒转染组共培养细胞上清液TNF-α、iNOS及VEGF的浓度均增高,细胞TNF-α、iNOS、Syncytin-1、VEGF mRNA和蛋白的表达均增高,ASCT1 mRNA和蛋白的表达均降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论骨骼肌细胞Syncytin-1过表达可以引起共培养细胞炎性因子释放、ASCT1表达降低、神经保护因子VEGF表达增高。
简介:摘要血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖在高血压、动脉粥样硬化、再狭窄等心血管疾病的发生、发展中起着重要的作用。中药对VSMCs的细胞周期进行调控,有效抑制血管平滑肌细胞的增值,日益备受关注。本文综述了目前中药对VSMCs细胞周期调控的相关研究。
简介:目的:研究巴戟天寡糖(MorindaofficinalisHowoligosaccharides,MOO)诱导成肌细胞增殖、分化的机制并观察其是否可诱导心肌细胞标志物的表达,为临床探索运用心脏组织工程学治疗心肌梗死提供更有效的依据。方法:采用出生1~3d的SD大鼠乳离体差速贴壁法纯化培养双侧后肢骨骼肌成肌细胞的方法,用24h后的原代成肌细胞进行试验。实验分5组:空白对照组、5-氮杂胞苷(10μmol/ml)阳性药对照组、MOO各剂量(100gg/ml、300gg/ml、500μg/m1)组。分别检测以下指标:(1)观察加药前后成肌细胞形态学改变。(2)Desmin(结蛋白)鉴定。(3)加药前后成肌细胞对异丙肾上腺素(Isoprenaline,IP)的反应。(4)采用RT-PCR法检测成肌细胞中TGF-β1、GATA-4mRNA的表达。结果:(1)与空白对照组相比,MOO诱导48h后成肌细胞生长密集,胞浆丰富,增殖明显,具有较好的折光性。并呈一定方向性的长轴平行排列,细胞融合的肌管增多,分化良好,有明显自发性搏动的收缩现象,生长状态明显好于空白对照组。(2)与空白对照组相比,IP对阳性药对照组和MOO小剂量组成肌细胞正性变时作用不明显(P〉0.05);而IP对MOO中剂量组和大剂量组成肌细胞正性变时作用显著(P〈0.05)。
简介:目的:观察巴戟天寡糖(MorindaOfficinalisHowOligosacchalide,MOO)对成肌细胞增殖分化的影响。方法:采用离体纯化培养乳鼠双侧后肢骨骼肌成肌细胞的方法,制成浓度为1×10^5/mm3的成肌细胞悬液,接种到25ml培养瓶中培养。实验分为5组:空白对照组5.氮杂胞苷(5-Aza)(10μmol/mL)对照组;MOO小、中、大剂量(100μg/ml、300μg/ml、500μg/m1)组;并检测以下指标:1.成肌细胞形态学变化。2.免疫细胞化学法鉴定结蛋白(Desmin)。3.免疫细胞化学法测定转化生长因子β1(TGF—β1)和增殖细胞核抗原(PCNA)。4.四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测巴戟天寡糖对成肌细胞增殖的影响。5.绘制生长曲线。结果:1.倒置显微镜下,成肌细胞培养24h后,可见大量折光率强的圆形细胞贴壁,且有极少量细胞有小突起;48h后,细胞呈梭形并出现单个细胞核;72h后,成肌细胞变得细长,并相互拉网,从单核期进入合体细胞阶段;继续培养,成肌细胞相互融合,形成多核性长管状初生肌管;培养第5天后,可观察到分化状态较好的肌管有自发性搏动的收缩;用desmin抗体对分裂增殖4~5天的成肌细胞进行间接免疫酶染色,细胞核外周及胞浆呈棕黄色的desmin阳性反应,表明培养的细胞为成肌细胞;成肌细胞生长曲线显示原代成肌细胞生长培养48h后开始增生,早期增殖较快,倍增时间为5d,6~7d进入平稳期。