简介：

简介：Micro-electrondiffraction(MicroED)isanemergingtechniquetousecryo-electronmicroscopetostudythecrystalstructuresofmacromoleculefromitsmicro-/nano-crystals,whicharenotsuitableforconventionalX-raycrystallography.However,thistechniquehasbeenpreventedforitswideapplicationbythelimitedavailabilityofproducinggoodmicro-/nano-crystalsandtheinappropriatetransferofcrystals.Here,wedevelopedacompleteworkflowtopreparesuitablecrystalsefficientlyforMicroEDexperiment.Thisworkflowincludesinsituon-gridcrystallization,single-sideblotting,cryo-focusionbeam(cryo-FIB)fabrication,andcryo-electrondiffractionofcrystalcryo-lamella.ThisworkflowenablesustoapplyMicroEDtostudymanysmallmacromolecularcrystalswiththesizeof2-10μm,whichistoolargeforMicroEDbutquitesmallforconventionalX-raycrystallography.Wehaveappliedthismethodtosolve2.5Acrystalstructureoflysozymefromitsmicro-crystalwithinthesizeof10×10×10μm^3.OurworkwillgreatlyexpandtheavailabilityspaceofcrystalssuitableforMicroEDandfillupthegapbetweenMicroEDandX-raycrystallography.

简介：

简介：在situ杂交(ISH)的RNA，包括发色的ISH(CISH)并且荧光灯ISH(鱼)，为在模型有机体揭示基因抄本的空间分发成为了一个强大的工具。以前，我们在豌豆蚜虫Acyrthosiphonpisum为整个山的RNACISH开发了一个柔韧的协议，一个新兴的昆虫genomic模型。以便改进基因察觉的解决的能力，我们包括地调查了整个山的RNA鱼的当前的协议并且开发了允许的协议用共焦的显微镜学，目标送信人RNA(mRNAs)的更清楚的可视化-与空间地重叠包括subcellularly局部性的那些和那些表示。我们发现那快基于染料的底层荧光(SF)，tyramide信号扩大(TSA)，和加所有的TSA启用识别基因表达式感谢到复合扩大荧光灯信号。由对比，直接荧光(DF)的方法不允许设想信号。一个单个基因目标的察觉与SF和为大多数mRNAs正的TSA被完成，而TSA仅仅在细菌房间允许象Apvas1和Appiwi2那样的丰富的抄本的可视化。为用两倍鱼的多重基因目标的察觉，我们推荐：(i)TSA/TSA，而非为colocalizedmRNAs正的TSAPlus/TSA富有地在细菌房间表示了，当朊酶K处理能被省略；并且(ii)为象酶的inactivation结合的Apen1和Apen2那样的另外的基因目标正的SF/TSA没被要求。SF/SF不由于信号变模糊为两倍鱼实验是理想的。为RNA鱼基于这些新条件，我们在豌豆蚜虫获得了germline说明和胚胎的分割的更好的理解。我们预计为豌豆蚜虫的RNA鱼协议可以也被用于另外的蚜虫并且可能另外的昆虫种类，因此扩展进开发和进化的有用卓见可以从被获得的种类的范围。