简介:目的:探讨hTERT反义寡核苷酸(ASODN)抑制CM-319细胞端粒酶活性对脊索瘤细胞的细胞周期及增殖的影响。方法:用脂质体介导hTERT正义寡核苷酸(SODN)和反义寡核苷酸(ASODN)转染CM-319脊索瘤细胞株72小时后,MTT法检测细胞活性,流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡率变化。结果:hTERT的ASODN转染细胞的端粒酶活性及细胞生长都明显受到抑制。流式细胞仪检测显示:ASODN组细胞出现早期凋亡峰,细胞阻滞于S期,而hTERT的SODN则无此作用。ASODN组细胞凋亡率为16.01%,而hTERT的SODN组为2.3%。结论:端粒酶hTERT为靶点的反义寡核苷酸可明显抑制脊索瘤细胞的增殖,且具有促凋亡作用。
简介:富甘氨酸寡核苷酸(G-richoligonucleotides,GROs)是一类新型的磷酸二酯寡核苷酸,可以形成G-四聚体(G-quartet)结构,能诱导多种白血病细胞系的细胞周期停滞于S期,通过非反义途径发挥抑制生长作用。本研究旨在探讨GRO-26B对白血病细胞系的增殖抑制及对细胞周期和形态的影响,并探讨相关机制。采用MTT法检测细胞增殖情况;流式细胞术分析细胞周期改变;Westernblot观察细胞周期调控相关蛋白的表达变化;光学倒置显微镜及透射电镜观察细胞形态及超微结构改变。结果表明,实验药物GRO-26B对髓系白血病细胞系如U937、NB4等起作用,抑制细胞增殖,诱导细胞周期停滞于S期,进而导致细胞死亡。对淋巴细胞系如Jurkat、Nalm6的增殖抑制作用不明显,GRO-26B处理后可观察到细胞体积明显变大,部分细胞内可见大量空泡,部分晚期细胞皱缩,细胞核碎裂,逐渐死亡裂解。电子显微镜下超微结构变化更明显。GRO-26B处理的u937细胞周期蛋白B1表达下降(处理24小时即开始下降,72小时更加明显);CDC2表达增加。周期蛋白A、CDK2培养24小时表达无明显变化,72小时则不同程度升高。结论:GRO-26B明显抑制髓系白血病细胞系U937、NB4等的增殖,诱导细胞周期停滞于S期,细胞周期的停滞与细胞周期蛋白/细胞周期蛋白依赖激酶(CDK)有关。
简介:摘要遗传性视网膜变性在临床上缺乏有效的治疗手段,基因治疗有望从根本上恢复遗传物质的功能,为其提供新的治疗策略。反义寡核苷酸(AON)是一种小分子核酸类药物,可以通过碱基互补配对原则与信使RNA特异性结合,从而在转录和翻译水平干扰或恢复基因表达。AON具有特异性高、微量高效、靶向范围广、免疫原性低、毒性及不良反应小等优势,成为遗传性眼病治疗新手段。目前,已有3种不同的AON药物进入了遗传性视网膜变性疾病的临床试验阶段。本文就近年来AON在其化学结构修饰、特性和作用机制等方面的进展及其目前在不同遗传性视网膜变性疾病中应用的治疗策略进行综述。
简介:目的用合成仪自动地合成60mer寡核苷酸SARS冠状病毒的探针来制作寡核苷酸基因芯片。方法根据寡核苷酸探针的制作要求,选取SARS冠状病毒的特异序列30条、长度为60mer的片段进行合成,并对合成后的纯化方法与条件进行探索。将经12%变性PAGE胶纯化后的探针直接点样制备成12×12阵列的寡核苷酸的基因芯片,初步与处理后的临床样品进行杂交。结果经PAGE纯化的寡核苷酸探针的纯度高,能满足寡核苷酸芯片制备的要求。临床SARS患者标本进行处理后与寡核苷酸芯片杂交、扫描检测,效果较好。结论本室合成的60mer的寡核苷酸SARS冠状病毒探针能用于基因芯片的制备与检测,这为该疾病的实验室诊断提供了一种快速、平行的检测方法。
简介:目的:探索针对诱导性组织因子(TF)高表达的靶向抑制的方法,探讨针对TF启动子-247~-230区域的诱骗寡核苷酸对U937-PR9细胞中PML/RARα融合蛋白诱导的TF表达是否存在竞争性抑制作用。方法:采用诱骗寡核苷酸技术,模拟TF启动子-247~-230的序列.人工合成该片段的双链DNA.转染U937-PR9细胞.通过流式细胞术监测转染效率并确定最佳电转浓度.通过实时PCR和酶联免疫吸附试验等技术.比较转染前后加Zn“组与不加Zn^2+组的TF表达水平变化。结果:流式细胞术显示.10μmol/L电转浓度下能够实现高效转染.标记的寡核苷酸在细胞内能够稳定存在72h。未转染对照组中,加Zn^2+诱导后TF表达明显上升:转染组中.加Zn^2+诱导的TF表达水平与不加Zn^2+组几乎没有差异。结论:特异性诱骗寡核苷酸对TF诱导性高表达存在靶向的竞争性抑制作用.该方法为急性早幼粒细胞白血病TF高表达引发的并发症提供了靶向治疗的新思路。
简介:以3缩水甘油环氧丙基三甲氧基硅烷对玻璃基片表面进行硅烷化后,用下列4种方法组装手臂分子:①盐酸直接处理;②先用聚六乙二醇,然后用盐酸处理;③用乙二胺、戊二醛、乙醇胺和硼氢化钠分别处理;④用聚六乙二醇、乙二胺、戊二醛、乙醇胺和硼氢化钠分别处理.用XPS(X-rayphotoelectronspectroscopy)和测定接触角的方法对上述组装进行了表征,并用直接偶联荧光单体及合成20mer寡核苷酸与带荧光的互补探针杂交的方法对上述手臂分子的合成效率及杂交效率进行了考察.实验表明方法③组装的手臂分子得到的结果优于其他3种方法,证明了手臂分子的空间效应、亲水性等性质对寡核苷酸合成和杂交存在影响.
简介:目的探讨bcl-xl反义寡核苷酸(ASODN)在裸鼠人鼻咽癌移植瘤细胞中的吸收和分布。方法应用流式细胞仪检测MCF和PPSC;用荧光显微镜观察ASODN在移植瘤细胞内的定位和分布。结果流式细胞仪检测结果显示,对照组、ASODN组和ASODN/Lip组MCF值分别为0.22±0.25,1.76±0.56和2.04±0.67;PPSC的平均值分别为(1.30±0.40)%,(45.5±8.63)%和(50.6±4.75)%,后两组与对照组比较差异有显著意义,ASODN组和ASODN/Lip组比较均无显著性差异(P<0.05),荧光显微镜观察到ASODN主要分布在细胞浆和细胞核内。结论裸鼠移植瘤鼻咽癌细胞可有效地摄取ASODN,且ASODN主要分布在细胞浆和细胞核内。在本实验条件下未观察到脂质体促进ASODN向细胞内转运,只是可能改变了ASODN的分布,主要分布在细胞核内。
简介:目的验证包载反雄激素受体基因三螺旋形成寡核苷酸(TFO)的聚乙二醇-聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PEGPLGA)纳米粒子(TFO—NPs)对前列腺癌细胞的生长抑制作用。方法采用改良自乳化溶剂挥发法制备TFO—NPs并进行体外物化表征。将TFO—NPs、脂质体包载的TFO(TFO—Lip)和裸TFO分别转染体外培养的LNCaP细胞,倒置荧光显微镜观察转染效率,MTT法检测细胞增殖活性,RT—PCR和Westernblot方法检测AR基因表达。结果TFO-NPs平均粒径128nm,载药量为1.02%,包封率为72.28%,在体外具有缓释作用。LNCaP细胞对TFO—NPs和TFO-Lip的摄取率显著高于裸TFO。TFO—NPs和TFO—Lip对LNCaP细胞的抑制率分别为(54.5%±6.2%)和(50.6%±6.1%)显著高于裸TFO,(7.8%±0.8%)(均P〈0.05)。TFO—NPs和TFO—Lip处理组LNCaP细胞的雄激素受体表达水平显著低于裸TFO处理组。TFO—NPs和TFO—Lip处理组的转染效率、细胞抑制率和雄激素受体表达水平差异均无显著性。结论成功制备了TFO—NPs,为反基因治疗前列腺癌的研究提供了有效基因载体。
简介:本研究探讨基因芯片在儿童白血病8种常见融合基因检测中的应用。采用多重巢式RT-PCR结合寡核苷酸芯片方法对84例临床收集的白血病标本进行融合基因检测。结果表明:此芯片可以从患者骨髓样本RNA中准确检测到阳性参照序列以及与融合基因相对应的特异基因片段。84例白血病患者骨髓标本中,31例(36.90%)具有8种染色体结构畸变产生的融合基因。包括te1/am11、e2a/pbx1、bcr/ablp190、bcr/ablp210、m11/af4、am11/eto、pm1/rarα、cbfβ/myh11。芯片检测的敏感性及特异性和RT—PCR方法相当。结论:采用多重巢式RT—PCR结合寡聚核苷酸芯片方法,可快速并同时筛选出8种染色体结构畸变产生的融合基因,为儿童白血病危险分层、治疗选择、预后判断提供重要依据。此种方法应用于筛查初治白血病儿童融合基因表达时优缺点并存,具有一定临床实用价值。
简介:目的:研究反义寡核苷酸(antisenseoligodeoxynucleotides,AS-ODN)抑制早期生长反应基因1(earlygrowthresponsegene-1,Egr-1)表达对内皮细胞缺氧复氧(anoxia/reoxygenation,A/R)损伤的影响。方法:采用新生大鼠进行心脏微血管内皮细胞(cardiacmicrovascularendothelialcells,CMECs)原代培养,取3~4代的CMECs建立缺氧复氧模型。细胞随机分为6组:对照(Con)组、缺氧复氧组(A/R)、溶剂组(LIP)、反义寡核苷酸转染组(AS)、正义寡核苷酸转染组(S)和错配寡核苷酸转染组(Sc)。通过测定细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)及内皮细胞中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量,观察内皮细胞损伤程度;应用ELISA法测定细胞培养上清液肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量,观察内皮细胞炎症反应水平;Western-blot法检测培养内皮细胞中Egr-1的蛋白表达水平;显微镜下观察细胞形态学改变并计算存活率。结果:A/R造成内皮细胞内MDA升高,SOD下降,上清液中LDH、TNF-α含量升高,A/R刺激下细胞Egr-1的蛋白表达水平明显升高;A/R刺激前给予AS-ODN可抑制Egr-1蛋白的表达,减轻内皮细胞的损伤及炎症反应程度,提高细胞存活率。结论:AS-ODN抑制培养内皮细胞Egr-1的表达,并降低A/R损伤,提示Egr-1与缺氧复氧所致的心脏微血管内皮细胞损伤密切相关。