简介:过去常用经典的Nadi反应显示细胞色素氧化酶以定位线立体的存在部位,现在广泛使用DAB法.我们对这两种方法进行了比较.方法如下:取Wistar大鼠的心、肝、肾组织,用液氮骤冷,恒冷箱切片(厚7μm),进行以下实验:Nadi反应:切片入孵育液(N-苯基-对-苯二胺3mg、1-羟基-2-萘酸3mg溶于二甲基亚砜0.1ml,0.05M的磷酸缓冲液pH7.210ml,混匀后过滤)室温30min.入Lugol碘液2min,入5%硫代硫酸钠4min,入1%醋酸钴60min,蒸馏水洗,甘油明胶封固.DAB法:切片入孵育液(0.05M磷酸缓冲液pH7.210ml,3,3′-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)9mg,细胞色素C15mg,混匀后过滤)室温5min.切片用缓冲液清洗,入蒸馏水,甘油明胶封固.HE染色:切片先用10%Formalin固定10min,再做常规HE染色.对照:Nadi反应和DAB法都用迭氮钠预孵育5min(10ml缓冲液中含6mM迭氮钠),再入含6mM迭氮钠的孵育液中孵育,以下的步骤与上述步骤相同.DAB法还用不含细胞色素C的孵育液做对照.实验结果:HE染色的切片显示组织结构正常.Nadi反应的阳性产物为黑绿色的颗粒,可见弥散的现象.DAB染色的阳性产物为棕色颗粒,很少见有弥散现象.对照切片的结果:用迭氮钠制酶活性的Nadi反应有弱阳性产物,而用迭氮钠的DAB法细胞色素C的切片均呈阴性反应.我们认为显示细胞色素氧化酶的经典方法Nadi反应存在反应产物弥散的现象,用迭氮钠抑制酶的活性后仍有阳性产物出现,因而该法只能表明线粒体的存在,而其定位不够准确.DAB法的方法简便,反应产物不易扩散,可较准确地定位线粒体的存在部位.另外,DAB的沉淀物能与四氧化锇反应形成锇黑,可用于电镜观察.经以上的实验观察和比较,我们认为无论从反应的特异性、定位的准确性,还是电镜应用性等方面看,显示细胞色素氧化酶的DAB法都优于Nadi反应.
简介:一氧化氮合酶(NOS)为一含铁的单氧化酶,可催化左旋精氨酸转化为瓜氨酸和NO.而阿霉素(ADR)是一种有效的广谱抗肿瘤药物,由于其心脏毒性作用,使临床应用受到限制.我们在探讨阿霉素对心脏损伤病理机制的实验研究中,用双重组化法同时显示心室肌NOS与糖元获得成功,现报道如下:1.材料和方法:1.1动物模型新西兰纯种白兔于耳缘静脉注射ADR,每次2mg/kg,ADR以生理盐水稀释成1mg/ml,每周一次,共八周,做心室肌损伤模型.取心室肌组织做冰冻切片,厚12μm.1.2主要试剂(1)还原型尼克酰胺嘌呤二核苷酸脱氢酶(NADPH-d);(2)四唑仑硝基兰(NBT);(3)0.5%过碘酸氧化液;(4)Schiff液:先将200ml双蒸水煮沸,微火,加入1g碱性复红,再煮沸1min.冷却至50℃加入20ml1N盐酸,待35℃时加入1g偏重亚硫酸钠.室温中静置5小时,变为无色液体后装入棕色瓶内并封口,放入冰箱避光保存待用.1.3双重组化法.(1)将冰冻切片置入丙酮固定1min;(2)经pH7.4PBS液清洗三次,每次5min;(3)入NADPH-d与NBT配制的孵育液,37℃恒温孵育1h;(4)经pH7.4PBS液清洗三次,每次3min;(5)入0.5%过碘酸氧化10~20min;(6)经pH7.4PBS液充分清洗;(7)入Schiff液10min液10min;(8)流水冲洗10min;(9)无水乙醇脱水;(10)二甲苯透明,中性树胶封片.1.4单一组化法显示NOS.(步骤参照双重组化法1~4步)1.5单一组化法显示糖元.(步骤参照双重组化法5~8步).2.实验结果:2.1双重组化法显示心室肌中NOS呈蓝色、糖元呈红色.2.2单一组化法显示心室肌中NOS呈蓝色.2.3单一组化法显示心室肌中糖元呈红色.结论:通过三组切片的比较,发现使用两种方法所显示NOS与糖元的颜色及其深浅无明显变化.3.意义3.1用双重组化法可以同时显示心室肌NOS和糖元.此法与单一显示NOS组化法和单一显示糖元组化法进行比较,结果显示NOS与糖元的颜色均无明显改变.此结果说明两组试剂的染色过程不产生交叉影
简介:“名师”在《辞海》中解释为“著名的老师”,指在一定地域范围内有影响、有声望、有名气的著名老师”。狭义地说,名师特指教育人才的精英,教育工作者的杰出代表,教育理论的创立者和教育实践的带头人。简言之,狭义名师是包括广大优秀教师在内的名家和大师。2003年的教师节,教育部启动了国家级教学名师奖评选这一高等教育质量工程的重要项目。随着国家级教学名师评选的开展,各省、校亦相继开展了相应级别的教学名师的评选。为了深人贯彻落实“教育部关于进一步加强普通高等学校教学工作提高教学质量的若干意见”文件精神,提高高校教师整体素质、创新教学、提高教育质量、积极探索适应时代发展要求的现代教育教学思想、方法和人才培养模式,川北医学院推出了“教学名师”工程。通过教师评议,学生无记名投票,学院共评选出首届三位校级教学名师。解剖学教研室的佘教授以其高度的责任感、丰富的教学经验和高尚的人格魅力当之无愧地成为了首届三大名师之一。为了探索名师教学规律,激发大批年轻教师脱颖而出,迅速提高高校师资队伍整体水平和教学质量,笔者通过一年多以来全程聆听解剖名师的理论课和实验课,将其教学方法分析整理如下,以资借鉴。
简介:目前,在供体器官短缺的情况下,大家公认猪是最合适的异种器官和组织的提供者,用猪肝细胞治疗急性肝衰病人已有报道.如何将肝细胞最大限度完整地、无损伤地分离出来,这是非常关键和重要的一步.我室在进行猪肝细胞的分离中,逐渐探索出一套比较行之有效的方法.材料与方法:采用中国实验用小型猪,常规麻醉、消毒、开腹,用D-Hank′s液进行肝脏原位灌注,再用0.02%EDTA-Hank′s液(37℃)灌注18~20min,摘取肝脏行多点灌注5min,置肝脏于60目钢网上,用直剪迅速剪开肝脏被膜,用镊子夹起轻轻抖动,并用1640液冲洗,边抖动边冲洗,使细胞滤出漏于烧杯中.与此同时,用剪刀把肝组织剪成小块,再用玻璃注射器芯轻轻研磨,边研磨边冲洗,操作要轻,并保持无菌,收集肝细胞,离心洗涤三次,并逐级用80目、100目、120目、150目钢网过滤.分离出的肝细胞进行计数、台盼蓝拒染试验检查、PAS染色、葡萄糖-6-磷酸酶染色及电镜检查.结果:肝细胞存活率90±1.3%,PAS染色显示肝糖元丰富,葡萄糖-6-磷酸酶染色显示酶的活性良好.电镜观察,肝细胞的线粒体、内质网等亚显微结构未见异常.对于猪肝细胞的分离,国外文献报道多采用Ⅳ型胶原酶循环灌注法,但费用很昂贵.在实践中,我们用EDTA代替胶原酶,采用肝脏原位灌注+多点灌注+机械研磨的方法,取得了较为满意的效果.此法与胶原酶灌注法比较,从分离的肝细胞数量、活力、肝糖元及细胞中一些酶的活性都与胶原酶法无显著差异,且光镜及电镜观察,显示细胞形态及亚细胞结构未见异常.我们认为此方法易于控制,价格低廉;而胶原酶法容易消化过度,造成细胞膜破损,或消化不完全造成多个细胞连在一起,且费用昂贵.实验证明,改良的猪肝细胞分离方法为用猪肝细胞治疗急性肝衰病人的研究提供了一个可行的方法.