HPLC波长切换法同时测定消银片中4种成分

崔璐1，巩长芹1，付霞1

（1.临沂市检验检测中心，山东 临沂276000）

摘要：目的 建立HPLC波长切换法同时测定消银片中绿原酸、芍药苷、牛蒡苷、丹皮酚的含有量。方法 采用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm)；以乙腈-0.1%磷酸为流动相，梯度洗脱；柱温为30℃；流速为1.0mL∙min-1；检测波长为327nm（绿原酸）、230nm（芍药苷、牛蒡苷）、274nm（丹皮酚）。 结果 绿原酸、芍药苷、牛蒡苷、丹皮酚分别在4.217～105.425、3.843～96.075、7.020～175.500、1.050～26.250μg∙ mL-1范围内线性关系良好，平均加样回收率分别为100.04%、97.36%、99.48%、98.44%，RSD分别为0.95%、1.04%、1.17%、0.97%。结论 该方法简单准确，重复性好，可用于消银片的质量控制和质量评价。

关键词：消银片；HPLC法；绿原酸；芍药苷；牛蒡苷；丹皮酚

Simultaneous determination of four constituents in Xiaoyin Tablet by HPLC with Wavelength Switching

Cui Lu1,Gong Changqin1,Fu Xia1

(1.Linyi Inspection Test Center,Linyi 276000,China)

ABSTRACT：AIM To establish a HPLC method for the simultaneous determination of chlorogenic acid、paeoniflorin、arctiin、paeonol in Xiaoyin Tablet by HPLC with wavelength switching. METHODS The analysis were carried out on a Agilent  ZORBAX SB-C18 column（4.6mm×250mm，5μm) with the mobile phase consisting of acetonitrile-0.1% phosphoric acid in a gradient mode at a flow rate of 1.0 mL∙min-1.

The detection wavelength was set at 327nm for chlorogenic acid,230nm for  paeoniflorin、arctiin,and 274nm for paeonol.The column temperature was set at 30℃. RESULTS Chlorogenic acid、paeoniflorin、arctiin、paeonol showed good linear relationships within the ranges of 4.217-105.425、3.843-96.075、7.020-175.500、1.050-26.250μg∙ mL-1，whose average recoveries were 100.04%、97.36%、99.48%、98.44% with the RSDs of 0.95%、1.04%、1.17%、0.97%，respectively. CONCLUSION This simple，accurate and reproducible method can be used for the quality control of Xiaoyin Tablet.

KEY WORDS：Xiaoyin Tablet；HPLC；chlorogenic acid；paeoniflorin；arctiin；paeonol                                                                                                                                                                                                            

消银片属“首批国家中药保护品种”，临床上主要治疗银屑病、扁平疣、湿疹、荨麻疹等皮肤病[1]。该制剂由地黄、牡丹皮、赤芍、当归、苦参、金银花、玄参、牛蒡子等13味中药材组方而成，具有清热凉血，养血润燥，祛风止痒的功效[1]。该制剂现行质量标准[1]中分别对芍药苷、苦参碱进行含量检测，该方法需要两个不同的液相系统，操作费时且成分覆盖不全面。文献报道中大多

[2-6]采用HPLC法分析消银片中1～2个成分，难以从整体上对消银片质量实行有效控制。鉴于该组方中牡丹皮具清热凉血、活血散瘀之功，赤芍清热凉血、散瘀止痛，二者相配伍，活血不动血、凉血不留痕；金银花、牛蒡子清热解毒，疏散风热、宣肺透疹，故选择上述四味中药的活性成分丹皮酚、芍药苷、绿原酸、牛蒡子作为质控成分，来更全面地评价药品质量。由于各组分最大紫外吸收波长不同，为了使各组分都能获得良好的响应，本试验拟建立HPLC-波长切换法，以期同时测定绿原酸、芍药苷、牛蒡苷、丹皮酚的含量。

1 仪器与试剂

岛津LC-2040C高效液相色谱仪；XS205型电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；KQ-300DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。绿原酸（批号110753-202018，质量分数96.1%）、芍药苷（批号110736-201741，质量分数95.7%）、牛蒡苷（批号110819-201611，质量分数95.9%）、丹皮酚（批号110708-201908，质量分数99.8%）对照品均购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈均为色谱纯，纯净水为Millipore纯化水，其余试剂均为分析纯。消银片由黑龙江福和制药集团股份有限公司提供（批号：201129、191130、200609、200620、210701）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脱（0～40min，10%A→50%A）；流速1.0 mL∙min-1；柱温为30℃；波长切换（0～10min，在327nm波长下检测绿原酸；10～30min，在230nm波长下检测芍药苷、牛蒡苷；30～40min，在274nm波长下检测丹皮酚）；进样量10μl。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取丹皮酚对照品10.52mg，置20ml量瓶中，加50%甲醇水溶液使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为丹皮酚对照品储备液。精密量取上述丹皮酚对照品储备液5ml，分别精密称取绿原酸、芍药苷、牛蒡苷对照品10.97mg、10.04mg、18.30mg，置同一25ml量瓶中，加50%甲醇水溶液制成每1ml含绿原酸0.4217mg、芍药苷0.3843mg、牛蒡苷0.7020mg、丹皮酚0.1050mg的混合对照品储备溶液。精密吸取上述混合对照品储备液1ml，置10ml量瓶中，50%甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 取消银片适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇水溶液50ml，密塞，称定重量，超声（功率300W，频率25kHz）提取30分钟，放冷置室温，称定重量后用50%甲醇水溶液补足减少的重量，摇匀，静置，取上清液过0.45μm滤膜，即得。

2.2.3 阴性对照样品溶液 分别取阴性对照样品（缺金银花、缺赤芍和牡丹皮、缺牛蒡子、缺牡丹皮，其余按照处方比例以及工艺制备）0.5g，按“2.2.2”项下方法制备阴性对照样品溶液。

2.3 专属性试验及系统适用性试验 取上述混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照样品溶液各10μl，按“2.1”项色谱条件进行测定，记录色谱图（见图1）。从图中可见，供试品色谱中，在与混合对照品色谱峰保留时间相同的位置上，均显示相同保留时间的色谱峰，在各阴性对照样品色谱图中，均未出现相应色谱峰，说明处方中其他药味对测定成分无干扰，专属性良好。绿原酸、芍药苷、牛蒡苷、丹皮酚色谱峰与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，峰分离完全。

A.对照品溶液 B.供试品溶液 C.缺金银花阴性对照样品溶液 D缺赤芍和牡丹皮阴性对照样品溶液 E.缺牛蒡子阴性对照样品溶液 F.缺牡丹皮阴性对照样品溶液 1.绿原酸 2.芍药苷 3.牛蒡苷 4.丹皮酚

图1  专属性试验HPLC色谱图

2.4 线性关系考察 分别精密吸取“2.2.1”项下混合对照品储备液溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml，置10ml容量瓶中，加50%甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀，过0.45μm滤膜，即得系列浓度的混合对照品溶液，分别精密吸取上述溶液各10μl，按照“2.1”项下色谱条件进行峰面积测定。以各指标成分的质量浓度为横坐标（X，μg∙mL-1），峰面积积分值为纵坐标（Y）进行线性回归，得绿原酸、芍药苷、牛蒡苷、丹皮酚的线性回归方程，分别为：Y= 3.202×104X+4.410×103（r=0.9998）、Y=1.408×104X-8.607×103（r=0.9999）、Y= 1.607×104X+2.949×103（r=0.9999）、Y= 5.403×104X-2.139×103（r=0.9998），结果显示，绿原酸在4.217～105.425μg∙mL

-1、芍药苷在3.843～96.075μg∙mL-1、牛蒡苷在7.020～175.500μg∙mL-1、丹皮酚在1.050～26.250μg∙mL-1范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验 精密吸“2.1.1”项下混合对照品溶液10μl，按“2.1”项色谱条件进行分析，连续进样6次，记录绿原酸、芍药苷、牛蒡苷、丹皮酚的峰面积并计算RSD值，分别为0.05%、0.51%、0.06%、0.07%，说明仪器的精密度良好。

2.6 稳定性试验  取一批样品（批号为201129），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件分别在0，6、12、18、24h记录各待测组分的色谱峰，并计算峰面积RSD值。结果表明，绿原酸、芍药苷、牛蒡苷、丹皮酚RSD分别为0.77%、0.74%、0.89%、0.61%，表明供试液在室温条件下24h内保持稳定。

2.7 重复性试验  精密称取同一批号样品（批号为201129）6份，按“2.2.2”项下方法平行制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件进样，计算4种待测组分平均含量及RSD值。计算结果为绿原酸、芍药苷、牛蒡苷、丹皮酚平均含量为4.221 mg/g、3.640 mg/g、6.761 mg/g、1.243 mg/g，RSD分别为0.54%、0.67%、0.52%、0.65%，表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验 分别精密称定各成分含量已知（批号为201129，绿原酸4.221mg/g、芍药苷3.640 mg/g、牛蒡苷6.761 mg/g、丹皮酚1.243 mg/g）的样品粉末0.25g，共6份，分别精密加入“2.2.1”项下的对照品储备液2.5ml，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1”项色谱条件进行测定，计算加样回收率，结果见表1。结果绿原酸、芍药苷、牛蒡苷、丹皮酚的平均加样回收率(n=6)分别为100.04%、97.36%、99.48%、98.44%，RSD分别为0.95%、1.04%、1.17%、0.97%，说明该方法回收率良好。

表1 加样回收率试验结果（n=6）

成分	样品含量/mg	加入量/mg	测得量/mg	回收率%	平均回收率/% （RSD/%）
绿原酸	1.0552	1.0542	2.1035	99.44	100.04
	1.0679	1.0542	2.1263	100.40	（0.95）
	1.0632	1.0542	2.1153	99.80
	1.0730	1.0542	2.1335	100.60
	1.0860	1.0542	2.1262	98.67
	1.0616	1.0542	2.1301	101.36
芍药苷	0.9101	0.9426	1.8251	97.07	97.36
	0.9210	0.9426	1.8284	96.27	（1.04）
	0.9170	0.9426	1.8522	99.21
	0.9254	0.9426	1.8375	96.76
	0.9366	0.9426	1.8537	97.29
	0.9155	0.9426	1.8354	97.59
牛蒡苷	1.6903	1.7550	3.4373	99.54	99.48
	1.7105	1.7550	3.4780	100.71	（1.17）
	1.7031	1.7550	3.4396	98.95
	1.7186	1.7550	3.4382	97.98
	1.7396	1.7550	3.4728	98.76
	1.7004	1.7550	3.4717	100.93
丹皮酚	0.3108	0.2625	0.5697	98.63	98.44
	0.3146	0.2625	0.5716	97.90	（0.97）
	0.3132	0.2625	0.5707	98.10
	0.3160	0.2625	0.5723	97.64
	0.3199	0.2625	0.5774	98.10
	0.3127	0.2625	0.5759	100.27

2.9 样品含量测定 分别取5批消银片，研细，称取0.5g，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件进行测定，对各指标成分计算含量，结果见表3。

表3  样品测定结果（mg/g）

批号	绿原酸	芍药苷	牛蒡苷	丹皮酚
201129	4.221	3.640	6.761	1.243
191130	3.622	2.494	6.013	0.815
200609	4.044	3.018	6.137	0.690
200620	4.206	3.467	5.968	1.491
210701	3.269	2.814	5.510	1.068

3 讨论

3.1 提取溶剂和方法的选择 本试验考察了回流提取法和超声提取法，发现二者在提取效果上无明显差异，所以选用了操作简便﹑省时节能的超声提取法。采用单因素试验方法分别对样品的取样量（0.25、0.5、1.0、2.0g）、提取溶剂（甲醇、50%甲醇、稀乙醇）以及提取时间（10、30、45min）进行考察，结果表明50%甲醇的提取效果优于其他溶剂，30min即可将成分基本提取完全，故确定取样量0.5g，50%甲醇为提取溶剂，超声提取时间为30min，该方法简单快捷，提取效率高。

3.2 流动相的选择 本试验分别考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-磷酸（0.1%、0.3%）等流动相体系中四种成分的分离情况，发现乙腈的洗脱效果优于甲醇；水相系统中芍药苷、绿原酸峰有拖尾现象，加入适量磷酸后，芍药苷、绿原酸峰的拖尾明显改善；而磷酸的浓度（0.1%、0.3%）对分离效果影响不明显。因此试验选用乙腈-0.1%磷酸溶液作为流动相体系。该条件下各待测成分色谱峰均能达到分离度要求、各峰理论塔板数高﹑对称性好﹑无前沿或拖尾现象。

3.3 检测波长的筛选 本试验对绿原酸、芍药苷、牛蒡苷、牡丹皮对照品在200～400nm波长范围进行扫描，光谱图显示4个待测成分最大吸收波长分别为327nm、230nm、227nm、274nm。通过对不同色谱柱[Agilent ZORBAX SB-C18（4.6mm×250mm，5μm)；PhenomenexGemini C18 110A（4.6mm×250mm，5μm)；Waters Xbridge C18（4.6mm×250mm，5μm)]考察，确定了波长切换时间。最终检测波长确定为0～10min时327nm检测绿原酸，10～30min时230nm检测芍药苷、牛蒡苷，30～40min时274nm检测丹皮酚，既能使各待测组分保留最大吸收，又能避免干扰成分对待测组分的影响。

4 结论

本试验建立了HPLC-波长切换法，同时测定消银片中绿原酸、芍药苷、牛蒡苷、丹皮酚四个成分的含量，并且使用该方法成功地对五批消银片进行了含量测定。结果表明，该方法回收率高﹑重复性好﹑可操作性强，与现行标准相比，能更为全面的评价消银片质量，对消银片及相关制剂的质量控制有重要意义。

参考文献：

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作者简介：崔璐，女，主管中药师，研究方向：中药质量控制