蓝色金纳米花在HPV快速检测试纸中的应用研究

林楷辉

山东协和学院  山东济南  250200

摘要；目的：建立一种快速、准确、简便检测高危型人乳头瘤病毒16型的胶体金诊断试纸条,以用于宫颈癌的早期筛查。方法：用柠檬酸三钠还原法制备了酒红色的30nm胶体金颗粒,胶体金颗粒标记的单抗的实际标记量为6μg/mL。选用了2种稳定剂BSA和PEG 20000获得了稳定的金标抗体溶液。结论:第7种样品垫处理液和第7种结合垫处理液处理样品垫和结合垫组装的试纸条效果最好;试纸条检测HPV 16E 6蛋白为阳性,检测HPV 16L1蛋白为阴性。危型HPV感染可导致宫颈癌及宫颈癌前病变(CIN),而持续性HPV感染与CIN病变进展的关系又甚为密切,故高危型HPV检测对宫颈癌的早期筛查、防治及在预测CIN的自然转归、治疗后的随诊上都有重要的作用。

关键词：蓝色金纳米花；快速检测试纸；HPV

一、资料

一般资料：

（1）选取实习医院确诊的宫颈癌患者136例为研究对象，年龄20-40岁。

（2）纳入标准：①患者符合AＲA1987年修订的诊断标准，②患者及家属知情并签署知情同意书。

（3）排除标准：①合并恶性肿瘤患者;②合并其他免疫功能低下患者;③合并全身感染性疾病患者;④合并其他免疫系统疾病患者。

（4）材料与设备:紫外分光仪10%柠檬酸三钠溶液(现配现用)，10%氯金酸溶液(密封、避光，4℃保存)，10%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)，胶体金洗液，胶体金保护液，ＲF重组抗原和ＲF单抗

二、实验方法:

1.样本采集。所有研究对象均于清晨采取尿液3mL，离心处理后，置于－20℃保存。所有临床标本均利用全自动生化分析仪（试剂盒购自宁波美康生物有限公司，检测线性范围: 9～ 120IU/）L 检测ＲF，三孔检测，结果取平均值。挑选出ＲF检测值在 120 U/L，80 U/L，60U/L，40U/L，30U/L，15U/L，12U/L及小于10U/L的成人临床血清(检测值不在本研究所使用试剂盒检测线性范围内，未将数据列出)，利用经国家食品药品监督管理总局(CFDA)批准的ＲF定量试剂进行标定，标定为最终浓度为100U/L、60U/L、50U/L、30U/L、20U/L、15U/L、10 U/L 及低值血清。

2.蓝色金纳米花试纸制备。①蓝色金纳米花制备:采用柠檬酸三钠还原氯金酸水溶液法制备胶体金，4℃贮存;并利用电镜观察和紫外－可见光扫描，对胶体金进行品质鉴定。②免疫金制备:将蓝色金纳米花溶液pH调整至7．0～8．5，本研究选择缓冲液为0．2M碳酸钾溶液; 通过初步标记制备免疫金，用ＲF 阳性血清点样，挑选出显色最佳的抗原，为本实验研究所用。③组装:利用HM3030平台系统在玻璃纤维上喷金标抗原，利用HM3030平台系统将ＲF抗原喷于硝酸纤维膜NC将标记好的免疫金重悬，喷涂胶金垫，37℃干燥2h，将NC膜、胶金垫、样品垫、吸水纸组装于底板上，切割为4mm宽的试纸条。

3.试纸条性能检测。①灵敏度检测:利用制备获得的GICA试纸条分别检测ＲF定值血清样本，观察结果。检测GICA试纸条稳定性，将试纸条置于室温(18～22℃)条件下干燥保存，每月定期抽检至第12个月，与放置于4℃同期制的试纸条同时检测相同样品观察结果。②精密度检测:利用30U/L的定值样品平行检测10次观察结果。③临床考核:利用本研究制备获得的蓝色金纳米花试纸条对研究组及对照组血清样本进行检测观察结果，与某试剂盒生产厂家的爱诺心试剂盒检测结果进行比较。

4.观察指标:（1）蓝色金纳米花试纸的灵敏度、稳定性、精密度检测结果。对本研究制备的蓝色金纳米花免疫层析试纸的灵敏度、稳定性、精密度、临床效果进行评价:将血清样本加到检测卡的样本垫上，10min后观察，检测线和质控线均出现红色条带，样本为阳性;检测线上无红色条带，质控线有红色条带，样本为阴性;质控线无条带，试纸条无效。

（2）蓝色金纳米花条方法检测与爱诺心试剂盒检测宫颈癌患者血清ＲF的准确性比较。

5.统计学处理:使用SPSS20．0统计软件进行数据分析，计数资料以［n(%)］表示，进行χ2 检验，组间计数资料比较采用χ2检验。P＜0．05 为差异有统计学意义。

三、结果

1.试纸条灵敏度为20U/L。利用高值ＲF样品(阳性)检测，检测线出现红色条带，质控线出现红色条带;且随ＲF定值血清浓度升高，检测线颜色加深，质控线出现深红色条带;当定值血清浓度为低值血清、10U/L、15U/L，检测线无红色条带，逐渐升高定值血清浓度，直至20U/L时出现红色条带，质控线有深红色条带; ＲF定值血清浓度为100U/L，60U/L，50U/L，30U/L，20U/L，检测线均有红色条带，质控线有深红色条带。判断本研究制备的蓝色金纳米花纸条灵敏度为20U/L。

2.与爱诺心试纸相比蓝色金纳米花试纸的稳定性、灵敏性、精密度更高。

四、问题与展望

虽然本研究完成了高危型人乳头瘤病毒16E6的蓝色金纳米花的研制,检测HPV16E6蛋白时可以显色,但灵敏度只达7.5ng,不是很高,需要进一步优化实验条件。试纸条只是检测了HPV16E6蛋白阳性和HPV 16L1蛋白阴性,还需要检测500～1000例以上宫颈癌患者的宫颈脱落细胞是否显色和检测其他肿瘤蛋白是否显色。本研究的试纸条形成了HPV16诊断试纸的基本生产工艺,需要进行生工艺和质量的研究、临床前和临床研究等,才能完成商品化的开发,所以仍有大量的后续工作该试纸可用于宫颈癌疾病的辅助诊断，对同类试剂的研发具有借鉴意义。

参考文献

［1］中华医学会风湿病学分会．2018中国类风湿关节炎诊疗指南［J］．中华内科杂志，2018，57( 4) : 242-251．

［2］杨文浩，刘宁，舒荣，等．类风湿关节炎并发代谢综合征的相关因素分析［J］．中华风湿病学杂志，2018，22(9):616-620．

［3］孙兴，李茹，李玉翠，等．免疫球蛋白G型类风湿因子在类风湿关节炎诊断和预后判断中的意义［J］．中华风湿病学杂志，2018，22(4):220-223．

作者简介：

林楷辉 男 福建宁德 2004.01专科在读 研究方向：基础医学

通讯作者：曲媛媛，女，汉族，山东威海，1985年1月，硕士研究生，副教授，研究方向基础医学。