芍药苷含量测定方法完善的研究

苏小媛

云浮市食品药品检验所 广东省云浮市 527300

摘要：目的:探讨HPLC法试验复方黄连素片含量测定项下芍药苷重现性差的原因，以及解决办法。方法： 按《中国药典》2020年版一部^［1］标准规定进行检测，以十八烷基硅胶键合硅胶为填充剂，乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(15:85)为流动相；检测波长为230nm。流速每分钟为1.0ml，柱温35℃，理论板数按芍药苷峰计应不低于2000。结果：实验中将芍药苷的测定方法加以改进，重现性好，产品稳定性良好。结论：本研究中复方黄连素片芍药苷含量测定项的改进方法操作简单，效果显著。可以广泛应用于复方黄连素片的质量分析^［2］检测与监测中，可为药厂的生产提供有价值的参考。

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关键词：高效液相色谱；色谱柱；芍药苷;稳定性；色谱柱冲洗；流动相

概述

　　复方黄连素片作为一种临床应用较为广泛的中成药，功效与主治为清热燥湿，行气止痛，止痢止泻。用于大 肠湿热，赤白下痢，里急后重或暴注下泻，肛门灼热；肠炎、痢 疾见上述证候者。其含量测定^［3］项下芍药苷的稳定性试验在原标准方法条件下得到的实验结果往往不理想，在运行批处理过程容易出现基线不平稳和目标峰漂移的问题。为了提高该产品含量测定方法的准确性，提高检验效率，结合本所工作实际，并仔细开展了如下的实验研究^［4］。

1.仪器与主要试药：

1.1仪器：

此次检测中使用的高效液相色谱仪为岛津高效液相色谱仪LC-20AD，本仪器主要由三元泵（A、B、C泵）、SPD-20A二极管阵列紫外可见光检测器、CTO-20AC柱温箱、CBM-20A系统控制器、DGU-20A5R在线脱气泵、SIL-20AC自动进样器、LabSolutions工作站组成。分析天平（万分之一，瑞士梅特勒-托利多XS系列XS205DU微量分析天平）；超声波震荡提取仪

1.2试剂：

乙醇（AR,天津市富宇精细化工有限公司，≥95%）、乙腈（色谱级，默克股份有限公司，含有≤100.0%乙腈）、磷酸二氢钾（AR,天津市大茂化学试剂厂，含量≥99.5%）、聚四氟乙烯微孔滤膜（25mm,0.22μm,津腾®）

1.3对照品：

芍药苷，来自于中国食品药品检定研究院，批号110736-201842，含量为97.4%；

1.4供试品：

药品名称：复方黄连素片；生产厂家：广东南国药业有限公司；规格：30mg*100片；批号：191001

2.方法与结果

2.1色谱条件

2.1.1含量测定项目：芍药苷(照《中国药典》2020年版一部及《中国药典》2020年版四部通则0512高效液相色谱法试验)

2.1.2色谱条件与系统使用性试验要求

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(15:85)为流动相；检测波长为230nm。理论板数按芍药苷峰计应不低于2000。

2.1.3对照提取物溶液的制备：取芍药苷对照品适量，精密称定，加 稀乙醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得。

2.1.4供试品溶液的制备：取本品20片，除去糖衣，精密称定， 研细，混匀，取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率 33kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重 量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.5测定法： 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。本品每片含白芍以芍药苷(C₂₃H₂₈O₁₁)计，不得少于0.65mg。

2.1.6具体实验条件控制

色谱柱：Agilent XDB（250×4.6mm，5μm）

柱温：35℃ 流速：1.0ml/min

2.2实验结果

　　以下为多次实验中，复方黄连素片芍药苷含量测定按照标准色谱条件进行实验，普遍得到的较差的色谱行为图谱：

图1复方黄连素片批处理中某一针的基线不平稳（优化条件前）

Fig.1 The baseline of a needle in the batch treatment of Compound Berberine Tablets is unstable (before optimizing the conditions)

图2

图3

图2-3 复方黄连素片批处理结果重现性差、基线不平稳、目标峰保留时间前移等问题（优化条件前）

Fig.2-3 Poor reproducibility of batch processing results of Compound Berberine Tablets, unstable baseline, forward shift of retention time of target peak and other problems (before optimization conditions)

图4 复方黄连素片批处理结果如上，均呈现基线不平稳情况（优化条件前）

Fig.4 The batch processing results of Compound Berberine Tablets were as above, and the baseline was unstable (before optimizing the conditions)

2.3实验结果分析

　　复方黄连素片在上述的色谱条件中得到的样品色谱峰基线不平稳、目标色谱峰保留时间前移、甚至在批处理中出现目标色谱峰丢失的情况。分析其原因是缓冲盐在使用过程中析出盐晶体，导致了柱压的升高、相同化合物保留时间发生变化、以及柱效下降等问题。这是由于本次实验用到的流动相为乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(15:85)，磷酸二氢钾溶液为缓冲盐溶液，缓冲盐在一般情况下易溶于水，而难溶于有机溶剂，当用含缓冲盐的（尤其是做流动相的水为饱和的缓冲盐溶液时）流动相进行分析时，而分析前由于反相色谱柱是保存在甲醇或乙腈等有机相当中的，此时色谱柱含水比例相对较低，若不先冲洗掉而直接进行样品分析，则不足以溶解该缓冲盐，缓冲盐将会在色谱柱柱体上析出，并沉淀下来，这将导致色谱柱的损害。缓冲盐析出容易堵塞填料基质上的微孔和颗粒间的空隙，柱压上升；同时，凝结在键合相表面，阻碍了基质上键合的碳链自由舒展，导致色谱柱的保留能力下降，柱床变松，继而柱效下降。因此，在使用缓冲盐溶液作为流动相时必须做好色谱柱使用前的处理，用前应做好柱子和系统的过渡处理。即用前需要用不含缓冲盐的流动相冲洗色谱柱，直至基线平稳。原则上，用于冲洗的流动相与分析时用到的流动相含水的比例相同（或者含水更高），不同的是用于冲洗的流动相中不含缓冲盐。然而，本次实验在做好上述前处理工作后，排除其他相关影响因素外，得到的样品色谱行为仍然较差，故而考虑对样品分析过程进行条件的优化。

2.4条件优化------批处理过程交替插入冲洗色谱柱方法

2.4.1色谱柱梯度冲洗方法

鉴于标准所用流动相为以乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(15:85)，而为了优化^［5］复方黄连素片芍药苷含量测定的批处理色谱行为，考虑将原流动相去除缓冲盐，并按一定的梯度洗脱程序

流动相：流动相A为乙腈，B为水，按以下表1梯度洗脱程序进行优化试验。

时间（分钟）	流动相A（%）	流动相B（%）
0~20	40	60
20~30	40→85	60→15

表1

Tab.1

2.4.2优化实验条件后结果

图5优化实验条件后多组样品色谱图

Fig.5 Chromatograms of multiple groups of samples after optimizing experimental conditions

3.结果分析与讨论：

3.1结果分析

　　结果表明，在优化实验条件后，以上各批次复方黄连素片芍药苷含量测定项在运行批处理后，系统压力稳定了，样品色谱基线稳定性大大提高了，重现性亦高，不再出现目标色谱峰丢失的情况。

3.2结果讨论

　　使用缓冲盐时要注意流动相混合以后盐可能析出的问题和盐背景吸收导致基线漂移严重的问题，在使用缓冲盐作为流动相时，可按实际需要用不含缓冲盐的流动相冲洗色谱柱，直至基线平稳，原则上用于冲洗的流动相与分析样品过程用到的流动相含水的比例相同（或者含水比例稍高），不同的是用于冲洗用的流动相中并不含缓冲盐，原因是缓冲盐一般易溶于水，而难溶于有机溶剂。因此，在用含缓冲盐的（尤其是做流动相的水为饱和的缓冲盐溶液时）流动相进行分析时，在分析过程中，如果不先冲洗掉，接下来做样品的时候用到的流动相有机溶剂占比大，而其比例中所含的水不足以溶解改缓冲盐时，缓冲盐将会在色谱柱柱体上析出，并沉淀下来，这将导致上述复方黄连素片芍药苷含量测定中基线不平稳，目标色谱峰消失不见的问题出现。可见，正确使用缓冲盐很有必要，既可以防止缓冲盐析出，也可以达到提高色谱柱使用寿命的目的。

4. 结束语

综上所述，使用HPLC法测定复方黄连素片含量测定中芍药苷项时，在《中国药典》2020年版一部标准色谱条件下实验时，为了提高供试品基线稳定性以及保证呈现目标色谱峰，按上述方法冲洗色谱柱，通过方法条件的优化后能取得了更好地应用效果，而且也符合药典要求，值得充分重视。此外，这也为经费有限，而手上拥有的色谱柱数量有限的实验人员解决了实际的科研难题，对科研探讨具有十分重要的意义！

参考文献

1. 国家药典委员会.中华人民共和国药典2020年版一部[S].北京：中国医药科技出版社，2020：1338-1339

2. 林林，林永强，汪冰，郭东晓，臧远芳，徐丽华. 复方黄连素片质量分析[ J] .药学研究，2013,32(3):157-158,164

3. 廖桂同，陈述. 复方黄连素片中盐酸小檗碱的含量测定[A]《World Chinese Medicine》doi:10.3969/j.issn.1673-7202.2015.02.025

4. 张林.复方黄连素片中芍药苷的含量测定方法研究[J]《黑龙江医药》，2016（009）024

5. 黄杰芳 防芷鼻炎片中芍药苷含量测定方法的优化[J]《中国现代药物应用》2012（006）008

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2020年版《中国药典》收载品种复方黄连素片中