三七皂苷R1对老龄大鼠学习记忆的作用及其机制

万丹丹李飞飞刘家言严孝强

（南京医科大学康达学院江苏南京210000）

【摘要】目的：探究三七皂苷R1对老龄大鼠学习记忆的作用及其机制。方法：20月龄SD雄性大鼠30只，以每组10只随机分为溶剂对照组、三七皂苷R1低剂量（5mg?kg-1）组和高剂量（10mg?kg-1）组，另取2月龄SD雄性大鼠10只为正常对照组。采用Morris水迷宫实验记录老龄鼠的行为变化。Westernbolt法测量PKA、P-CREB、BDNF含量。结果：三七皂苷R1能缩短老龄大鼠的逃避潜伏期并增加其穿越平台次数，使老龄大鼠脑组织中的BDNF的蛋白表达水平增高。结论：三七皂苷R1能改善老龄大鼠的学习记忆能力。BDNF信号通路是其作用机制之一。

【关键词】三七皂苷R1;老龄大鼠；Morris水迷宫;学习记忆;BDNF

【中图分类号】R965【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2016）28-0381-02

研究表明，衰老会导致人认知功能衰退和脑退行性疾病的发生[1]，学习记忆能力减退是早期表现之一[2]。三七皂苷R1是三七根茎中的一种活性成分[3]，其对人体的血液系统、心血管系统、神经系统和代谢系统具有一定的保护作用[4]。因此，本实验将研究三期皂苷R1对老年大鼠的学习记忆能力的作用。

1.材料与方法

1.1实验动物

SPF级20月龄雄性SD大鼠，体重400～500g；2月龄雄性SD大鼠，体重180～200g。均由南京医科大学实验动物中心提供，生产许可证：SCSK(苏）20020031。

1.2药品与试剂

0.9%氯化钠注射液，辰欣药业股份有限公司，产品批号：1404242143；三七皂苷R1，成都贝斯特世纪有限公司，产品批号：BRS011903；BDNF抗体，Sigma公司，产品批号：SAB4300702。

1.3实验动物分组

30只20月龄雄性SD大鼠,每组10只随机分为溶剂对照（Vehicle）组、三七皂苷R1低剂量（5mg?kg-1）组和高剂量（10mg?kg-1）组，另随机选取10只2月龄雄性SD大鼠为正常对照（Control）组。连续腹腔注射给药10天后进行Morris水迷宫实验。

1.4Morris水迷宫法检测大鼠学习记忆能力

Morris水迷宫实验是最常用于验证啮齿类动物神经认知疾病模型的和评估神经认知治疗可行性的实验，是最常用于评价动物的学习与记忆能力的实验。

Morris水迷宫主要由一个不锈钢圆形水池和一个可移动的平台组成。水池直径120cm，高70cm，水深50cm，水温25±2℃。水中加入墨汁，使其呈非透明状。平台(直径12cm、高45cm)隐藏于水下2cm处[7]。水池上空通过一摄像机与计算机相连，记录大鼠的运动轨迹。水池分为4个象限，平台置于第I象限。大鼠按Ⅱ～Ⅳ象限顺序入水，记录60s内从入水点到爬上平台所需的时间，即逃避潜伏期(Escapelatencytime)。若大鼠在60s内找到平台，则使其在平台上停留15s。若大鼠在60s内未找到平台，则引导大鼠找到平台，并使其在平台上停留15s，逃避潜伏期记为60s。三个象限潜伏期的平均值记为当天的平均平台潜伏期[8]。以此方式训练大鼠4d，每天2次，训练时间固定在每天9点和15点。第5天进行空间探索实验，大鼠按Ⅱ～Ⅳ象限顺序入水，记录60s内大鼠穿过原平台位置的次数。

1.5Westernbolt

Morris水迷宫实验结束后，在大鼠安静状态下断头处死，迅速取出脑组织（纹状体、海马、前额叶皮层、伏隔核），用滤纸吸干水分称重，按体重体积比加预冷的生理盐水制备成10％的组织匀浆，5000rpm/min，4℃离心20min，取匀浆上清液。用BCA法组织样品蛋白定量，加入蛋白上样缓冲液调至同一浓度，95℃水浴蛋白变性。上样（20ug/孔），8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜1.5h，5％脱脂奶37℃封闭2h，加入BDNF（1:1000）一抗，4℃孵育过夜；TBST洗膜3次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1:5000），室温孵育lh，TBST洗膜3次，ECL化学发光显影成像。ImageJ图像软件对各条带进行蛋白灰度分析。

1.6统计学处理方法

运用SPSS11.5统计软件处理分析实验数据，并以mean±s表示，采用方差分析和t检验进行组间差异分析，以P＜0.05为有统计学意义。

2.实验结果

2.1三七皂苷R1对老龄大鼠学习能力的影响

在Moms水迷宫实验中，随着训练时间的延长，所有组大鼠的平台潜伏期都逐渐缩短。与正常对照组相比，溶剂对照组大鼠的平台潜伏期明显增加（P＜0.01，见图A）。与溶剂对照组相比，三七皂苷R1低剂量组大鼠的平台潜伏期无明显差异（P＞0.05，见图A），而三七皂苷R1高剂量组大鼠的平台潜伏期明显缩短（P＜0.05，见图A）。

2.2三七皂苷R1对老龄大鼠记忆能力的影响

在Moms水迷宫实验中，与正常对照组相比，溶剂对照组大鼠的穿越平台次数明显减少（P＜0.01，见图B）。与溶剂对照组相比，三七皂苷R1低剂量组大鼠的穿越平台次数无明显改变（P＞0.05，见图B），而三七皂苷R1高剂量组大鼠的穿越平台次数明显增加（P＜0.05，见图B）。

2.3三七皂苷对老龄大鼠BDNF的蛋白表达水平的影响

与正常对照组相比，溶剂对照组大鼠脑组织中BDNF的蛋白表达明显降低（P＜0.01）。与溶剂对照组相比，三七皂苷R1低剂量组大鼠脑组织中BDNF的蛋白表达无明显变化（P＞0.05，见图C）,而三七皂苷R1高剂量组大鼠脑组织中BDNF的蛋白表达明显增高（P＜0.01，见图C）。

3.讨论

本实验中，相较于适龄大鼠，老龄大鼠平台潜伏期显著增加，穿越平台次数显著减少，提示大鼠的学习记忆能力随着大鼠年龄的增加明显降低。而腹腔注射三七皂苷R1后，老龄大鼠的大鼠平台潜伏期显著缩短，穿越平台次数显著增加，提示三七皂苷R1对老龄大鼠的学习记忆障碍具有改善作用。

海马是中枢神经系统学习记忆的关键部位，BDNF是其中的关键蛋白。三七皂苷R1能明显改善老龄大鼠的学习记忆能力，并使得BDNF的表达增加，因此，BDNF信号通路是其作用的机制之一。

【参考文献】

[1]李亚,王建军,蔡景霞.衰老及促智药影响神经细胞膜流动性机制的研究进展[J].动物学研究,2005,26(2):220．

[2]钟兴明,周颖杰,姚鸿恩.长期体育健身运动对老年人智力水平的影[J].中国康复医学杂志.2007(02).

[3]黄金兰,陆璐,黄丹等.三七总皂苷对快速老化痴呆模型小鼠SAMP8炎症因子及小胶质细胞的影响[J].中国实验方剂学杂志.2013(08).

[4]黄金兰,陆璐,黄丹等.三七总皂苷对快速老化模型小鼠大脑β-分泌酶活性及含量的影响[J].中国中西医结合杂志.2013(07).

[5]封敏,卢圣锋,张承舜等.国内大鼠Morris水迷宫实验现状与分析[J].辽宁中医杂志.2011(11).

[6]刘智勇,朱理.Morris水迷宫视频中目标识别与轨迹跟踪的研究与实现[J].计算机系统应用.2010(06).