浅谈小儿肺炎血清衣原体抗体微量免疫荧光法检测及分析

刘爽

哈尔滨市传染病医院150030

摘要：目的：研究分析沙眼衣原体（Ctr）、肺炎衣原体（Cpn）在不同年龄阶段肺炎小儿中的感染状况。方法：运用微量免疫荧光试验检测392例各年龄组肺炎住院儿童的血清Ctr、Cpn抗体。结果：共发现Ctr阳性44例，Cpn阳性89例。<28d组、1～11个月、1岁～2岁11个月、3～5岁11个月、6～14岁组患儿Cpn肺部现症感染率逐次增高，分别为0，1.19%，3.02%，13.74%，14.44%，中间3组每后一组均比前一组明显增高，差异有显著性（P<0.05）；Ctr肺部现症感染率则随年龄递增而逐次减低，分别为9.48%，4.15%，0.25%，0，0，前三组每相邻两组差异有显著性（P<0.01）。结论：Ctr、Cpn是小儿肺炎的重要病原体，小儿肺炎中Cpn感染致病的发病年龄有提前趋势，应引起儿科临床足够重视。

关键词：肺炎；沙眼衣原体；肺炎衣原体；微量免疫荧光法

Objective：TostudyandanalyzetheinfectionstatusofChlamydiatrachomatis（Ctr）andChlamydiapneumoniae（Cpn）inchildrenwithpneumoniaatdifferentages.Methods：theserumCtrandCpnantibodiesweredetectedbymicroimmunofluorescencetestin392childrenwithpneumoniainallagegroups.Results：44casesofCtrpositivewerefoundand89caseswerepositiveforCpn.<28Dgroup，1to11months，attheageof1to2yearsand11months，3to5yearsand11months，6~14yearsoldgroupwereinfectedwithCpn.Thelungsincreasedsuccessiveratewere0，1.19%，3.02%，13.74%，14.44%，3，middlegroupeachgroupwerehigherthanbeforegroupincreasedobviously，therewassignificantdifference（P<0.05）；Ctrlunginfectionratewithageincreasingandsuccessivedecrease，respectively9.48%，4.15%，0.25%，0，0，therewassignificantinthreegroupsbeforeeachoftheadjacentdifferencebetweenthetwogroups（P<0.01）.Conclusion：CtrandCpnareimportantpathogensofpneumoniainchildren.TheageofonsetofCpninfectioninchildrenwithpneumoniaisaheadofschedule，whichshouldcauseenoughattentioninpediatrics.

[Keywords]pneumonia；Chlamydiatrachomatis；Chlamydiapneumoniae；microimmunofluorescence

引起人类疾病的衣原体主要有沙眼衣原体（Chlamydiatrachomatis，Ctr）和肺炎衣原体（Chlamydiapneumoniae，Cpn）两种，其也是儿童呼吸道感染性疾病的重要病原体。而衣原体仅对大环内酯类抗生素敏感，故了解并及时正确治疗衣原体感染极为重要。微量免疫荧光法（micro-immunofluorescence，MIF）是WangSP在20世纪70年代建立的，主要用于血清流行病学的研究，对临床诊断也有莫大帮助。为了解儿童肺炎患者Ctr、Cpn感染情况，本课题组应用MIF对我院2005年1月~2006年12月间小儿肺炎患者中疑似衣原体肺炎者血清进行检测，现报道如下：

1材料与方法

1.1研究对象

2015年1月～2016年12月收入我院儿科住院的肺部感染患儿。入选年龄为新生儿～14岁，共1563例，其中<28d组306例、1～11个月组337例、1岁～2岁11个月组398例、3～5岁11个月组342例、6～14岁组180例。

1.2方法

选取临床疑似病例392例接受了微量免疫荧光试验检测。留取入院次日及恢复期双份静脉血标本，分离出血清后-20℃保存待检，用倪安平[1]和WangSP等[2]描述的微量免疫荧光法检测血清IgG和IgM抗体，对于符合Cpn感染而又有慢性感染迹象者加检查抗Cpn-IgA抗体。IgM阳性血清标本进一步检测类风湿因子（RF）以排除假阳性。所用抗原由北京协和医院提供，结合物是兔抗人IgG和羊抗人IgM荧光抗体（Sigma公司）。羊抗人IgA荧光抗体是德国Enroimmun公司产品。Cpn感染的血清学诊断标准为①急性感染：双份血清抗体效价升高4倍以上，或IgM≥1∶16，IgG≥1∶512；②既往感染1∶16≤IgG≤1∶256且IgM<1∶16；③再次感染：IgG常在1~2周出现，且效价很高≥1∶512，而IgM测不出或效价很低；④Cpn慢性感染：Cpn-IgA≥1∶100且排除急性感染。Ctr感染的血清学诊断标准[3，4]：双份血清IgG抗体效价升高4倍以上，或IgM≥1∶16。

1.3统计学分析

计数资料采用卡方检验，计量资料采用t检验。

2结果

2.1微量免疫荧光法检测结果

1563例患儿入院时诊断为肺炎，其中有392例接受了微量免疫荧光法检测，133例阳性（8.51%，44例Ctr、89例Cpn现症感染），Ctr肺炎组年龄（2.02±1.82）个月，Cpn肺炎组年龄（62.42±30.07）个月，两组间比较，t=18.75，差异有统计学意义（P<0.001）。其中，男孩87例，女孩46例，男女比例为1.89∶1；年龄9d～13岁，中位年龄3.75岁。Ctr、Cpn现症感染在<28d、1～11个月、1岁～2岁11个月、3～5岁11个月、6～14岁组分别有29和0例、14和4例、1和12例、0和47例、0和26例；<28d、1～11个月、1岁～2岁11个月、3～5岁11个月和6～14岁组患儿Cpn肺部感染率逐次增高，分别为0，1.19%，3.02%，13.74%，14.44%，中间三组每后一组均比前一组明显增高，差异有显著性（P<0.05）。而3～5岁11个月组和6～14岁组Cpn肺部感染率无显著性差异。Ctr肺部感染率则随年龄组递增而逐次减低，分别为9.48%，4.15%，0.25%，0，0，前3个年龄组每相邻两组差异非常显著（P<0.01）。本研究发现有Cpn慢性感染者2例，再次感染者5例。

2.2临床表现

2.2.1病程Cpn肺炎：9d～4个月，平均（25.3±15.90）d，其中<2周4例，～3周36例，～1个月21例，～3个月26例，>3个月2例；Ctr肺炎：13～63d，平均（22.55±7.02）d，其中<2周2例，～3周15例，～1个月14例，>1个月13例。两组间平均病程比较，t=1.41，差异无统计意义（P>0.05）。

2.2.2其他表现个别患者存在肝功能损害、心肌损害、消化道症状、血液系统受累、反应性关节炎等肺外表现。

3讨论

3.1本研究开展的背景

引起人类疾病的衣原体主要有Ctr和Cpn两种。另有鹦鹉热衣原体（Chlamydiapsittaci）偶尔可对人类致病，因比较罕见，本研究不作探讨。国外报道孕妇宫颈Ctr阳性率为2%～47%，其所生婴儿23%～70%被Ctr感染，3%～20%发生Ctr肺炎，18%～50%发生Ctr结膜炎，Ctr已成为新生儿肺炎的重要病原体[5]。Cpn是1989年由Grayston正式定名的衣原体新种，之前曾认为它是鹦鹉热衣原体的TWAR株。现已证明其感染呈世界性分布，每隔3～4年出现一次流行高峰，持续1～2年，目前已认识到Cpn是儿童呼吸道感染的重要病原体之一，被列为第3位或第4位的感染原，除可导致上呼吸道感染、支气管炎、肺炎等呼吸道疾病外，还与哮喘发作和动脉粥样硬化病变密切相关。衣原体仅对大环内酯类抗生素敏感，治疗不恰当的患儿常迁延不愈，因此，了解并及时正确治疗衣原体感染极为重要。

3.2衣原体的实验室检测及本研究采用的检测手段

随着临床检验技术的发展，人们发现Ctr、Cpn感染在儿童，特别是婴幼儿中的感染率不断增加。Ctr、Cpn的实验室诊断方法有病原体分离培养和直接检出、核酸检测和血清学实验。Ctr、Cpn分离培养方法复杂，费时，而且敏感性不高，一般不用于临床诊断。病原体的直接检出主要有免疫荧光试验和酶联免疫吸附试验（ELISA），采用荧光标记或酶标记抗体检测标本中的衣原体，前者主要用于细胞培养中衣原体的识别，近年也尝试直接应用于临床标本的检验，但其敏感性受标本采集的影响较大；后者所用抗体为抗衣原体属特异性抗体，不能直接识别Ctr、Cpn。核酸检测包括核酸杂交和聚合酶链反应（PCR），核酸杂交检测衣原体的特异性强，但敏感性不高，主要用于PCR结果的检测、判定，尚未直接用于临床标本的检测；PCR具有较高的敏感性，但PCR试验对实验室有特殊要求，实验室条件不够容易出现假阳性。有人报道，咽拭子CpnPCR阳性在急性和既往感染均可以发生，而对照组的健康者PCR衣原体阳性率达30%，说明PCR受条件影响，其结果有相当高的假阳性比率出现[6]，且咽拭子PCR阳性严格来说只反映局部带毒或局部感染。检测衣原体最常用的血清学方法是微量免疫荧光抗体检测法（MIF），被公认为衣原体感染血清学诊断的金标准。MIF方法的原理是用衣原体标准株制备抗原片，然后与病人血清反应，病人如为Ctr或Cpn感染，其血清中抗Ctr或抗CpnIgM或IgG就会与抗原片上的Ctr或Cpn抗原结合，加入抗人IgM或IgG荧光标记抗体后，在荧光显微镜下可观察到Ctr或Cpn颗粒。相对而言，MIF检测法敏感、特异、实用可行、可以反映即时感染情况，且可帮助区分急性或既往感染、再次感染、慢性感染，故此法不仅利于进行流行病学调查，在临床上也有较高的应用价值。

3.3衣原体在小儿肺炎中的感染状况与临床特点

有资料显示，在青少年约10%的肺炎与Cpn感染有关[7]；肺炎婴儿Ctr检出率可高达18.4%[8]。本组资料显示Cpn肺炎占同期全部小儿肺炎的5.69%、占3岁以上小儿肺炎的13.98%（73/522），Ctr肺炎则占同期全部小儿肺炎的2.82%、占1岁以内小儿肺炎的6.69%（43/643）。说明Ctr、Cpn是小儿肺炎的重要病原。本组资料显示，<28d组、1～11个月、1岁～2岁11个月、3～5岁11个月、6～14岁组的患儿Cpn肺部感染率逐次增高，中间三组每后一组均比前一组明显增高，其差异的显著性有统计学意义，笔者分析可能跟随着小儿年龄的增大而入托、入园、入学、在人群密集的小集体里增加Cpn传播的机会有关。Ctr肺部感染率则随年龄组递增而逐次减低，前3个年龄组每相邻两组差异有显著性，笔者分析可能跟随着婴儿月龄的增大而逐渐脱离母婴垂直传播这一主要的Ctr感染途径有关。既往认为，Cpn在下呼吸道的感染率以学龄期儿童较高，而婴幼儿较低[9]，但本组资料显示学龄前期儿童肺部感染率较高，较3岁以前的组别差异显著，而与学龄期组相比无显著性差异，提示小儿肺炎中Cpn感染致病的发病年龄有提前趋势，应引起临床医生高度重视。本组资料显示，Ctr肺炎组与Cpn肺炎组的发病年龄有非常显著性差异（t=18.75，P<0.001），新生儿、小婴儿Ctr肺炎相对高发，年长儿则Cpn肺炎相对高发。Ctr肺炎与Cpn肺炎病程方面两者比较无统计学差异。发热在Cpn肺炎组相对常见（35.96%），多数为中、低热，少数高热；而Ctr肺炎组一般无发热或仅有低热，发热出现率9.09%，有显著性差异。另外，除气急在Ctr肺炎组相对多见、肺部哮鸣音Cpn肺炎组相对多见且出现率有显著性差异外，其余多种症状、体征的出现率无统计学差异，表明两者的临床表现相近，并无各自的显著特点；同为Ctr肺炎或Cpn肺炎组内亦然，各年龄组间临床表现也相仿。故本病的诊断主要靠实验室诊断。总体而言，患儿症状表现轻重不一，多数病情不重但不少病例病程迁延，多数起病缓慢，常先有鼻塞、而后出现呼吸加快和频繁不连贯干咳；小婴儿常有咳后呕吐和发绀；新生儿偶见呼吸暂停，咳嗽症状存续的时间往往较长，急性期常伴声嘶，双肺可闻及干、湿啰音或哮鸣音，很多无发热，发热者也常见为低热。有人提出婴儿没有发热而表现为轻型呼吸困难是衣原体肺炎诊断的唯一线索。

3.4Cpn慢性感染

本组资料中有2例Cpn患儿在病程的早期检测Cpn-IgM阳性，分别经住院治疗8，12d后症状体征基本消失而出院，此后患儿一直少量单声或双声干咳，偶尔稍加重经门诊拟“支气管炎”治疗又获好转，病程3月余时咳嗽又加多而再次检测Cpn-IgG≥1∶512，IgA≥1∶100，经予红霉素30mg/（kg·d）静滴7d、继而阿奇霉素10mg/（kg·d）口服3d停5d后再口服3d而愈，表明存在Cpn慢性感染，而类似的Cpn慢性感染情况国外文献也有报道[10]，提示Cpn肺炎治疗后应注意随访。

参考文献

[1]倪安平，王辉，董平，等.肺炎、支气管炎和急性上呼吸道感染患者肺炎衣原体感染的研究[J].中华内科杂志，1995，34：388-391.

[2]WangSP，KuoCC，GraystonJT.FormalinizedChlamydiatrachomatisorganismsasantigeninthemicroimmunofluorescencetest[J].JCliMicrobiol，1979，10：259.

[3]吴仕孝.新生儿衣原体感染的临床特点及诊治[J].中国实用儿科杂志，1998，13（2），67-69.

[4]刘钢.衣原体及其相关疾病研究新进展[J].国外医学儿科学分册，1998，25（5），251-254.

[5]SollecitoD，MidullaM，BavastrelliM，etal.Chlamydiatrachomatisinneonatalrespiratorydistressofverypretermbabies：biphasicclinicalpicture[J].ActaPaediatr，1992，81：788.

[6]肖玉艳，牛秀英，梁燕生，等.支气管哮喘患者肺炎衣原体感染的临床研究[J].天津医药，2004，32（7）：439-441.

[7]孟宪红.小儿肺炎衣原体感染[J].国外医学儿科学分册，1995，22（1）：12-14.

[8]傅文永，刘桂英，张玉乾，等.婴儿沙眼衣原体肺炎病原学和临床的研究[J].中华儿科杂志，1995，33（6）：344-346.

[9]王亚娟，沈叙庄，佟月娟，等.肺炎衣原体在儿童急性下呼吸道感染中的情况[J].中华儿科杂志，2001，39（9），546-549.

[10]LaurilaAL，VonHertzenL，SaikkuP.Chlamydiapneumoniaeandchroniclungdiseases[J].ScandJInfectDisSuppl，1997，104：34-36.