简介:目的探讨以转染人血管内皮生长因子(Vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)基因的骨髓基质干细胞(Bonemarrowstromalcells,BMSCs)构建的组织工程骨在犬眼眶壁骨缺损中的修复效果。方法体外分离扩增犬自体BMSCs至第2代,用腺病毒转染VEGF基因。采用Real-timePCR和WesternBlot检测目的基因和蛋白表达情况。细胞接种在珊瑚支架材料上构建组织工程骨,Elisa检测转基因细胞在支架材料上的蛋白持续表达情况。成年比格犬24只,双侧眼眶内侧壁制造直径12mm圆形骨缺损模型,随机分为4组:A组植入转染VEGF的组织工程骨,B组植入未转染基因的组织工程骨,C组植入单纯珊瑚材料,D组为旷置组。分别在手术后4周、12周、24周取材,行大体观察、Micro-CT分析、免疫组化方法检测血管形成情况,以及组织学观察和组织形态学检测比较骨缺损修复效果。结果VEGF基因修饰的BMSCs能够高表达目的基因和蛋白,构建组织工程骨后能够在体外持续分泌VEGF蛋白22d。C组和D组均未修复眶壁骨缺损。A组在骨缺损修复过程中,4周时的新生血管形成量和新生骨体积明显高于B组(P〈0.05),但12周、24周时两组的新生血管量和新生骨量均无显著性差异(P〉0.05)。结论转染VEGF的BMSCs构建的组织工程骨体内回植后早期能够促进新生血管形成,加速新骨生成。
简介:探讨聚乙烯醇(PVA)纺丝纤维编织用I型胶原胶(COL-I)表面修饰后,构建组织工程前交叉韧带(ACL)支架材料的可行性。用PVA纺丝编织成条束状支架材料,用NIH-3T3细胞株和人前交叉韧带(HACL)细胞分别种植到PVA和经COL-I修饰过的PVA纺丝纤维编织(PVA/COL)支架材料上,立体培养。通过扫描电子显微镜对比评价材料经I型胶原胶表面修饰前后NIH-3T3细胞株和HACL细胞在纺丝编织材料上细胞附增殖情况;在电子拉力机上测试PVA纺丝纤维编织支架材料的力学性能。结果表明:NIH-3T3细胞株和HACL细胞在PVA和PVA/COL支架材料表面和孔隙内黏附增殖并分泌细胞外基质,在PVA/COL支架材料上细胞黏附数量明显增多;COL-I可促进NIH-3T3细胞株分泌细胞外基质,但对HACL细胞作用不明显。拉力测试该编织材料柔韧性强,最大负荷、极限应力和弹性模量分别为52.61N、14.96Mpa和202.08Mpa。说明I型胶原可促进NIH-3T3细胞株和HACL细胞在聚乙烯醇纺丝纤维编织支架材料表面和孔隙内黏附、增殖,可促进NIH-3T3细胞株分泌细胞外基质。聚乙烯醇纺丝纤维编织材料具有一定的...
简介:摘要目的通过组织学分析、免疫荧光染色、电生理检测和感觉运动功能评价等实验方法,探讨3D打印水凝胶支架联合骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)促进脊髓损伤功能恢复的有效性。方法将10%的GelMA水凝胶和106 U的BMSCs悬液配置成的生物墨水,通过3D打印平台组建仿生脊髓支架,置入培养基中并在37 ℃的CO2培养箱环境培养。通过扫描电镜观察支架的微观结构,大体观察BMSC在支架中的分布;利用CAM/PI染色和共聚焦显微镜观察干细胞在支架中的存活,测定支架的生物相容性;将支架植入大鼠背部皮下组织,利用HE染色测定皮下组织以检测支架的免疫原性;制备大鼠脊髓损伤半切模型,移植支架进行治疗,利用共聚焦显微镜评估脊髓损伤局部的神经元和轴突的再生情况;采用BBB评分进行运动功能评价;机械疼痛评分进行感觉功能评价;表面电极检测法评价电生理恢复效果。结果支架内部呈现网状疏松结构,长梭形的间充质干细胞在支架内外均匀分布;支架生物相容性良好,制备的支架在打印24 h后细胞存活率达到96%;皮下移植支架28 d后,免疫排斥反应轻微,免疫原性低;脊髓移植支架28 d后,通过HE染色观察到,与损伤组相比,治疗组的再生脊髓组织明显增多,其中广泛分布着细胞,通过免疫组化染色证实再生细胞部分为神经元;免疫荧光染色共聚焦显微镜观察到,与损伤组对比,支架治疗组损伤部位的再生神经元和轴突明显增多。BBB评分中,支架治疗组第一周10分,损伤组仅1分左右,差异有统计学意义(P<0.05);支架治疗组第4周为17分,损伤组仅恢复至4分左右,差异有统计学意义(P<0.05);治疗组的斜板支撑角度恢复至40°,而损伤组仅恢复至22°;治疗组的疼痛阈值降至18.5分,与损伤组无统计学差异;治疗组电生理的潜伏期恢复效果同假手术组,优于损伤组。结论3D打印水凝胶支架具有疏松网状结构适宜细胞存活增殖、生物性良好、细胞毒性低、免疫原性低等优良特性,促进损伤局部的神经元再生并伸出轴突,从而有效促进脊髓损伤后的运功功能、感觉功能和神经电信号传导速率的恢复。
简介:摘要生长因子在骨组工程修复重建中的时空分布至关重要。生长因子可通过不同的包载方式应用于骨组织工程中。不同的包载方式使生长因子具有不同的时空释放效果。目前,常用的物理包封、易降解的载体和简单的空间结构往往使生长因子早期突然释放,导致缓释效果不理想。优化生长因子的释放方式,使得生长因子可仿生地在不同时间和空间释放适量,有利于提高组织修复的效果和避免生长因子过量的不良反应。笔者从生长因子时空缓释的必要性入手,总结生长因子通过直接固定于载体表面、包封于载体、包封于微颗粒,以及微颗粒包封于载体等方式实现不同程度的时空缓释,对生长因子在不同包载方式的时空缓释效果进行综述,为优化生长因子在骨组织工程中精准可控地释放提供参考。
简介:摘要目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)/内皮祖细胞(EPC)作为种子细胞构建的基质依赖型组织工程骨(ECM-TEB)修复大鼠股骨缺损的效果。方法分离培养骨髓来源的MSC和EPC并进行功能鉴定,种植上架于纳米晶胶原基人工骨颗粒,培养14 d后冻干,获得MSC/EPC ECM-TEB和MSC ECM-TEB。扫描电镜观察MSC和EPC在支架表面的生长形态。分别提取MSC ECM-TEB蛋白浸提液(对照组)和MSC/EPC ECM-TEB蛋白浸提液(实验组),加入EPC培养系统中进行迁移、划痕修复、管腔形成检测;另加入MSC培养系统中进行茜素红染色和碱性磷酸酶(ALP)染色检测,观察两组细胞募集、血管生成和成骨分化情况。选取12只SD大鼠,建立股骨缺损模型,按照随机数字表法分为:(1)假手术组:仅在缺损处进行清创处理;(2)MSC ECM-TEB组:在缺损处植入MSC ECM-TEB;(3)MSC/EPC ECM-TEB组:在缺损处植入MSC/EPC ECM-TEB,每组4只大鼠。2个月后行Micro-CT检查和缺损区Masson三色染色观察骨缺损修复情况。冻干后低温保存3个月,采取同位素相对标记与绝对定量技术(iTRAQ)标记蛋白质谱检测MSC ECM-TEB和MSC/EPC ECM-TEB在成血管方面的差异,并采用基因本体论/京都基因与基因组百科全书技术(GO/KEGG)功能富集方法分析其原因。结果MSC和EPC在支架表面生长、增殖良好,形成光滑的细胞层状结构。实验组在细胞迁移数、划痕修复比例和管腔形成长度分别为(121.6±8.3)个、(61.5±5.9)%、(11.3±0.6)mm,较对照组显著增多[(85.0±6.7)个、(39.3±3.6)%、(5.9±0.4)mm](P均<0.01)。茜素红染色和ALP染色结果显示,实验组钙结节矿化面积比例显著增加[(38.8±3.3)%∶(49.9±3.0)%、(38.8±2.4)%∶(45.3±3.3)%] (P均<0.05)。Micro-CT和Masson染色结果表明,MSC/EPC ECM-TEB组骨缺损修复良好,MSC ECM-TEB组仅形成少量新骨,假手术组几乎没有新骨形成;骨体积分数、骨小梁数量和骨小梁厚度差异均有统计学意义(P<0.05)。蛋白质谱分析结果表明,与MSC ECM-TEB组相比,MSC/EPC ECM-TEB组中有83个血管生成相关的因子显著上调(差异倍数>2,P<0.05);GO/KEGG功能富集分析显示,与MSC ECM-TEB相比,MSC/EPC ECM-TEB在"血管发育"等生物过程存在明显差异(P<0.01),"血管平滑肌收缩通路"等显著增强(P<0.01)。结论与MSC ECM-TEB相比,MSC/EPC ECM-TEB在细胞募集、血管生成和新骨生成方面显著增强,是一种更佳的可用于创伤性骨缺损修复的组织工程骨构建策略。
简介:摘要目的以去细胞心内膜/弹力层微米颗粒为材料构建小口径组织工程血管支架,并种植经诱导的CD34+细胞初步观察内皮化效果。方法2018年1月至2019年12月以新鲜猪心脏去细胞心内膜作为内层,猪主动脉弹力纤维微颗粒多孔支架为外层;分层仿生构建小口径组织工程血管支架。提取骨髓间充质中的CD34+细胞,诱导向内皮细胞分化,种植于支架内表面,1周后行苏木精-伊红(HE)和免疫荧光染色,扫面镜观察其内皮化效果。结果制备得到外径为4 mm,内径为3 mm,厚0.5 mm的管状多孔支架。支架外层孔径为25~100 μm,孔隙度为70%;内层种植经诱导的CD34+细胞1周后,生物支架内皮样细胞覆盖率>90%。结论以去细胞心内膜/弹力层微米颗粒为材料构建的小口径组织工程血管支架,种植经诱导的CD34+细胞可以初步获得满意的内皮化效果,可以应用于下一步实验研究。
简介:摘要气管外伤、狭窄、肿瘤以及部分先天性疾病可严重损伤正常通气功能,引起组织缺氧,危及患者的生命。气管病变切除重建是治疗这些疾病最为有效的方法。目前在临床中仍无长期安全可靠的方法能够实现长段气管损伤后的重建,组织工程化气管可能是目前这种情况的解决方案。软骨作为组织工程气管结构中最重要的部分之一,起到提供力学支撑并维持气管整体性的关键作用。组织工程气管软骨再生过程中的几个重要组成部分包括软骨细胞的来源、组织工程支架的构建策略和水凝胶材料复合支架的制备、生物活性因子的研究和应用等,本文通过对这几个部分进行探讨,综述了组织工程气管软骨再生的新策略以及所存在的障碍,以期为临床提供参考。
简介:目的探讨猪肌腱细胞、真皮成纤维细胞、骨髓问充质干细胞中何种细胞最适宜作为体外组织工程化肌腱构建的种子细胞.方法收集猪肌腱细胞、真皮成纤维细胞及骨髓间充质干细胞,以50×106个细胞密度均匀接种于圆柱状聚羟基乙酸(Polyglycolicacids,PGA)上,按细胞种类分为三组,每组n=3,体外培养,并于1、2、6周取材,进行组织学检测、免疫组化检测、胶原定量测定和大体观察.结果细胞-PGA复合物体外培养时有细胞外基质产生,六周时肌腱细胞组产生胶原量最多,明显优于真皮成纤维细胞和骨髓间充质干细胞(p<0.01).免疫组化显示形成的主要为Ⅰ型胶原.结论体外构建组织工程肌腱时肌腱细胞合成胶原能力最强,在现有条件下是体外构建组织工程肌腱的最佳种子细胞.