简介：苏州高新区人民医院检验科 江苏 苏州215129 【摘要】 目的 回顾分析我院2018年1月1日至2018年12月31日分离的铜绿假单胞菌的耐药性及临床分布特点,为临床合理用药，减少耐药菌株产生提供依据。方法 用Vitek2 Compact对251株铜绿假单胞菌进行鉴定和药物敏感试验，以CLSI2018M100判定药敏，用WHONET5.6进行数据分析。结果 251株铜绿假单胞菌标本分布占比：痰液88.8%（233/251），分泌物6.0%(15/251)。药敏结果显示氨曲南耐药率最高，16.73%；头孢他啶和哌拉西林/他唑巴坦分别为13.55%和12.75%；亚胺培南11.55%；科室分布：神经外科110株，占44%；ICU52株，占21%；呼吸科37株，占15%；神经内科18株，占7%。神经外科和ICU耐药率最高；儿科喹诺酮类耐药率最高；所有分离株对氨基糖苷类敏感率高。结论 菌株主要来源于痰液标本，对β-内酰胺类药物耐药率最高，其中对碳青霉烯的耐药率居高。所以，临床应重视病原学送检，并根据药敏报告合理选用抗菌药物，防止多重耐药菌产生。

简介：摘 要：CB251GB井组位于埕岛油田东部区块，是胜利油田埕岛东区产能建设项目地重点井组，目的开发馆陶组油藏。埕岛东区上部地层疏松、成岩性差，易发生缩径、垮塌，砂岩地层、断层及不整合面附近，易发生井漏。明化镇组、馆上段存在气层，井控风险高。CB251GB井组为大斜度密集丛式井组，与同台井和邻近老井有极高的交碰风险，井斜大、位移大、裸眼段长，导致摩阻扭矩高，井眼清洁、井眼轨迹控制难度大。本文针对CB251GB井组的钻井工程难点进行了密集丛式井组优快钻井技术应用，包括钻井工程设计优化、钻头优选、提速工具优选、BHA优化设计、密集丛式井防碰技术应用、井眼清洁工具优配套，获得了良好的应用效果。

简介：摘要目的探讨羟基脲(HU)联合替莫唑胺(TMZ)加放疗(RT)对人脑胶质瘤U251细胞放化疗(CRT)敏感性的影响。方法体外培养U251细胞，采用CCK8实验检测不同浓度HU、TMZ及不同条件处理后细胞的增殖能力；流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期分布情况；Transwell小室、划痕实验评估细胞侵袭、迁移能力变化；Western blot实验检测凋亡蛋白表达情况；克隆形成实验检测克隆源细胞存活分数。结果HU浓度≤50μmol/L时不会显著影响U251细胞增殖(P>0.05)；低剂量HU联合CRT组较CRT组可抑制细胞增殖(P<0.05)、侵袭(P<0.01)、迁移(12h时P<0.001，24h时P<0.01)能力，并促进细胞凋亡(P<0.01)。50μmol/L HU联合RT后可增加细胞放射敏感性；细胞周期S及G2期显著延长(均P<0.05)；凋亡蛋白Caspase-3及Bax表达水平上升，抗凋亡蛋白Bcl-2水平下降(均P<0.001)。结论HU联合CRT较单纯CRT进一步抑制U251细胞增殖、侵袭及迁移能力，促进细胞凋亡及增加放射敏感性，且出现S期及G2期阻滞，从而增加了U251细胞的CRT敏感性。

简介：摘要目的探讨腺病毒介导的人工合成东亚钳蝎氯毒素（Ad-rBmK CTa）对人胶质瘤U251细胞的抑制作用及其相关机制。方法设置3.5×109、7.0×109、3.5×1010pfu/ml三个效价梯度Ad-rBmK CTa组，分别作用于U251细胞24、48、72 h，同时设置空白对照组（不加入细胞和Ad-rBmK CTa）、阴性对照组（只加入U251细胞）。通过激光共聚焦荧光显微镜观察病毒感染情况；采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测各组细胞增殖情况；采用流式细胞术检测各组细胞周期及细胞凋亡；采用蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白bax、bcl-2和caspase-3表达情况。结果Ad-rBmK CTa作用于U251细胞24 h后感染效率达90%以上。随着Ad-rBmK CTa效价升高，作用相同时间的U251细胞增殖抑制率逐渐升高（均P<0.01）；随着时间延长，同一效价Ad-rBmK CTa作用的U251细胞增殖抑制率亦逐渐升高（均P<0.01）。7.0×109 pfu/ml Ad-rBmK CTa作用于U251细胞48 h后，G0/G1期细胞比例为（40.7±0.8）%，S期和G2期细胞比例分别为（35.7±0.6）%、（23.6±1.4）%，差异具有统计学意义（F=225.119，P<0.01）。7.0×109 pfu/ml Ad-rBmK CTa作用于U251细胞24、48、72 h时，细胞凋亡率分别为（7.4±1.4）%、（19.2±1.7）%和（22.3±1.7）%，差异有统计学意义（F=49.470，P<0.01）。7.0×109 pfu/ml Ad-rBmK CTa作用于U251细胞48 h后，与阴性对照组相比，bax、caspase-3蛋白的表达水平升高，bcl-2蛋白表达水平下降。结论Ad-rBmK CTa可能作用于DNA损伤诱导的G1/S检测点，使细胞周期停滞于G0/G1期，从而抑制U251细胞的体外增殖，但其诱导U251细胞凋亡的作用并不明显。其机制可能与氯离子-通道直接或间接受到抑制相关。

简介：摘要目的探讨原儿茶酸(PCA)对人胶质瘤细胞株U251MG增殖、凋亡的影响及相关分子机制。方法常规培养人胶质瘤细胞株U251MG。应用噻唑蓝(MTT)技术检测0、2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L浓度PCA干预后各组细胞的活性。流式细胞术(FCM)检测PCA对U251MG细胞周期和凋亡的影响。应用实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)和蛋白质印迹法(Western blot)检测U251MG在药物干预前后增殖凋亡相关基因和的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路蛋白的变化，组间比较采用t检验。结果0 μmol/L的PCA干预48 h后细胞活性为0.881±0.079、2.5 μmol/L为0.757±0.077、5.0 μmol/L为0.600±0.101、10.0 μmol/L为0.532±0.056(F＝35.131，P<0.01)，差异有统计学意义。RT-qPCR和Western blot结果显示，随PCA浓度增加，增殖细胞核抗原(PCNA)的mRNA表达水平为1.172±0.153、0.756±0.059、0.601±0.061、0.390±0.059、0.236±0.036(F＝55.618，P<0.01)，差异有统计学意义；蛋白的表达水平分别为0.934±0.071、0.781±0.053、0.650±0.045、0.384±0.046、0.174±0.019(F＝113.681，P<0.01)，差异有统计学意义。FCM结果显示，PCA组U251MG细胞的G0/G1期比例[(71.033±8.570)%]高于对照组[(52.057±6.735)%，t＝3.015，P<0.05]，差异有统计学意义，G2/M比例[(18.833±7.639)%]低于对照组[(36.910±5.328)%，t＝-3.362，P<0.05]，差异有统计学意义；Western blot结果显示，增殖相关蛋白Cyclin A、Cyclin D1、Cyclin E表达在PCA组低于对照组(0.405±0.047比1.217±0.101、0.673±0.070比1.166±0.110、0.604±0.085比1.286±0.085，t＝-12.625、-6.549、-9.827，P<0.01)，而p21、p27表达在PCA组高于对照组(1.206±0.096比0.575±0.046、0.990±0.086比0.481±0.045，t＝10.267、9.083，P<0.01)。FCM结果显示，PCA组U251MG细胞凋亡率(29.971±7.572)%高于对照组[(10.264±3.121)%，t＝4.168，P<0.05]；Western blot结果显示，凋亡相关蛋白bcl-2、pro-Caspase-3、pro-Caspase-9表达在PCA组低于对照组(0.337±0.024比1.198±0.113、0.430±0.044比1.150±0.098、0.486±0.049比1.278±0.107，t＝-12.909、-11.609、-11.656，P<0.01)，bax、cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9表达在PCA组高于对照组(1.312±0.097比0.471±0.051、1.173±0.140比0.460±0.052、1.245±0.089比0.606±0.080，t＝13.292、8.269、9.249，P<0.01)。Westernblot结果显示，PCA组U251MG细胞MAPK信号通路中p-ERK表达明显低于对照组(0.591±0.047比0.989±0.084，t＝-7.162，P<0.01)。结论PCA能通过调控MAPK信号通路中p-ERK的活性而抑制胶质瘤细胞U251MG的增殖，并促进凋亡。

简介：摘要目的探讨微小RNA-4298(miR-4298)靶向抑制肽酰精氨酸脱亚胺基酶4(PADI4)表达在组蛋白去乙酰化酶抑制因子曲古抑菌素A(TSA)诱导U251细胞凋亡中的作用机制。方法实验分为TSA组(0.2 μmol/L TSA处理)和对照组。采用CCK8法检测TSA对U251细胞增殖的影响；流式细胞术检测药物作用后U251细胞的凋亡水平；反转录PCR和蛋白质印迹法测定miR-4298干扰后PADI4基因和蛋白表达的变化；Luciferase实验测定miR-4298对PADI4的3′UTR区靶向结合与荧光素酶活性的影响；PADI4转染U251细胞，观察miR-4298对凋亡功能的拯救作用。实验各分为3组，即NC组、miR-4298 mimic组、TSA+miR-4298 mimic组以及NC组、miR-4298 inhibitor组、TSA+miR-4298 inhibitor组。结果U251细胞经0.2 μmol/L的TSA作用4 d后，对照组的吸光度(A)值为1.168±0.148，高于TSA组的0.737±0.007，差异有统计学意义(t＝4.948，P＝0.008)。与对照组相比，经0.2 μmol/L TSA处理48 h后，U251细胞发生明显的凋亡现象(27.62%±3.49% vs. 4.99%±0.13%，t＝11.190，P<0.001)。与药物作用前相比，TSA作用48 h后，PADI4基因表达(0.386±0.020 vs. 0.903±0.021)和蛋白表达水平(0.276±0.041 vs. 0.777±0.031)均有所降低，差异均有统计学意义(t＝30.400，P<0.001；t＝16.770，)P<0.001。miR-4298在TSA诱导U251细胞凋亡的过程中表达升高(2.573±0.289 vs. 1.003±0.136；t＝8.487，P＝0.001)，并且miR-4298与PADI4的表达呈负相关(r＝-0.877，P＝0.002)。Luciferase实验证实，miR-4298对野生型PADI4的3′UTR区具有靶向结合和荧光素酶抑制作用。与NC组(0.920±0.026)相比，miR-4298 mimic组(0.413±0.049)和TSA+miR-4298 mimic组(0.213±0.035)PADI4基因相对表达水平均有所降低，差异均有统计学意义(均P<0.001)；其蛋白表达水平变化与基因变化趋势一致。与NC组(3.78%±0.68%)相比，miR-4298 mimic组(7.96%±1.10%)和TSA+miR-4298 mimic组(13.74%±1.26%)诱导细胞凋亡的水平均有所增加，差异有统计学意义(P＝0.005；P<0.001)。与NC组(0.183±0.025)相比，miR-4298 inhibitor组(0.483±0.032)和TSA+miR-4298 inhibitor组(0.386±0.025)PADI4基因表达均有所升高，差异有统计学意义(P<0.001；P＝0.015)。蛋白表达水平变化与基因变化趋势一致。与NC组(4.96%±0.59%)相比，miR-4298 inhibitor组(23.83%±2.20%)和TSA+miR-4298 inhibitor组(9.55%±1.49%)诱导细胞凋亡的水平均有所增加，差异有统计学意义(均P<0.001)。救援实验中，miR-4298 mimic组明显升高PADI4表达水平(P<0.001)，miR-4298 mimic+PADI4组则相对逆转PADI4表达水平(P＝0.002)。结论miR-4298可通过靶向调控PADI4基因表达参与U251细胞的凋亡发生过程，miR-4298可能是脑胶质瘤靶向干预治疗的靶点。

简介：摘要目的探讨来那度胺(LEN)联合替莫唑胺（TMZ）对TMZ耐药性人脑胶质母细胞瘤系U251/TR细胞增殖、侵袭、耐药性及O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)基因表观遗传修饰的影响。方法将前期应用分步诱导法成功构建的U251/TR细胞分为二甲基亚砜(DMSO)组、LEN组、TMZ组及LEN+TMZ组，其中DMSO组不进行任何药物干预，LEN组、TMZ组、LEN+TMZ组分别按LEN 100 μmol/L、TMZ 200 μmol/L、LEN 100 μmol/L+TMZ 200 μmol/L浓度处理U251/TR细胞（给药1次/24 h)。处理后24、48、72、96 h时，采用磺酰罗丹明B比色分析法检测细胞增殖率；处理后96 h时，采用Transwell实验检测细胞侵袭能力，采用流式细胞术检测细胞增殖周期，采用Western blotting实验、免疫组化染色、免疫荧光染色检测细胞中MGMT水平，采用RT-PCR法检测细胞中MGMT mRNA水平，采用甲基化特异性PCR检测细胞中MGMT基因启动子区甲基化情况。结果处理后24、48、72、96 h时，LEN+TMZ组的细胞增殖率较TMZ组、LEN组、DMSO组均明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。处理后96 h时，LEN+TMZ组的穿膜细胞数较其他3组均明显减少，G0/G1期细胞比例较其他3组均明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；TMZ组及LEN+TMZ组细胞中MGMT蛋白、mRNA水平较LEN组、DMSO组均明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；TMZ组及LEN+TMZ组中胞浆内MGMT表达呈强阳性或中等阳性的细胞数量较LEN组、DMSO组明显更少，MGMT荧光强度(+)较LEN组(+++)、DMSO组(+++)明显减弱。各组细胞中MGMT基因启动子区均为未甲基化状态。结论LEN单药对U251/TR细胞的增殖、侵袭无明显抑制作用，而LEN联合TMZ能抑制该细胞的增殖、侵袭并逆转其耐药性，但其机制与MGMT基因启动子区甲基化状态改变无关。

简介：摘要目的探讨脑胶质瘤U251多倍体巨细胞的体外构建方法并研究其对替莫唑胺的耐药性。方法通过慢病毒感染实验观察带有不同荧光标记的人脑胶质瘤U251细胞；采用植物血凝素-聚乙二醇融合法进行细胞融合；通过流式细胞分选实验检测体外携带双色荧光标记的胶质瘤多倍体巨细胞；采用碘化丙啶染色方法测定U251融合克隆细胞的DNA含量；通过CCK-8实验评价细胞的增殖率以及加入替莫唑胺后细胞的存活率。结果慢病毒感染实验成功获得分别带有绿色和红色荧光标记的胶质瘤U251细胞；细胞融合后显微镜下可见携带双色荧光的胶质瘤融合细胞，并且与聚乙二醇细胞融合法比较，植物血凝素-聚乙二醇细胞融合法的细胞融合率明显提高(自<1%提高至>5%)。流式细胞分选获得胶质瘤U251融合细胞单克隆株。DNA含量的检测结果显示，U251融合克隆细胞的DNA含量自之前的2N/4N提高至4N/8N。CCK-8实验结果显示，U251细胞接种后1、2、3、4及5 d的细胞增殖率分别为(99.5±2.6)%、(236.7±4.7)%、(348.9±8.8)%、(656.5±18.5)%及(715.7±48.2)%；而U251-C1多倍体巨细胞的细胞增殖率分别为(100.6±2.1)%、(114.5±1.3)%、(138.4±1.7)%、(316.7±23.1)%及(347.7±13.1)%，U251-C2多倍体巨细胞的细胞增殖率分别为(100.3±1.2)%、(114.7±1.2)%、(186.4±0.6)%、(307.1±9.5)%及(432.9±37.7)%，相较于胶质瘤U251细胞，U251多倍体巨细胞的不同克隆株(U251-C1、U251-C2)的增殖速度均明显减慢(均P<0.05)。替莫唑胺作用下，U251细胞和U251多倍体巨细胞(U251-C1、U251-C2)的细胞存活率均下降(均P<0.01)，而与U251细胞组比较，不同U251多倍体巨细胞株(U251-C1、U251-C2)的细胞存活率均更高(均P<0.01)。结论植物血凝素-聚乙二醇细胞融合法可在体外成功构建脑胶质瘤U251多倍体巨细胞；胶质瘤U251多倍体巨细胞可能对替莫唑胺的耐药性发挥重要作用。

简介：摘要目的探讨脑胶质瘤U251多倍体巨细胞的体外构建方法并研究其对替莫唑胺的耐药性。方法通过慢病毒感染实验观察带有不同荧光标记的人脑胶质瘤U251细胞；采用植物血凝素-聚乙二醇融合法进行细胞融合；通过流式细胞分选实验检测体外携带双色荧光标记的胶质瘤多倍体巨细胞；采用碘化丙啶染色方法测定U251融合克隆细胞的DNA含量；通过CCK-8实验评价细胞的增殖率以及加入替莫唑胺后细胞的存活率。结果慢病毒感染实验成功获得分别带有绿色和红色荧光标记的胶质瘤U251细胞；细胞融合后显微镜下可见携带双色荧光的胶质瘤融合细胞，并且与聚乙二醇细胞融合法比较，植物血凝素-聚乙二醇细胞融合法的细胞融合率明显提高(自<1%提高至>5%)。流式细胞分选获得胶质瘤U251融合细胞单克隆株。DNA含量的检测结果显示，U251融合克隆细胞的DNA含量自之前的2N/4N提高至4N/8N。CCK-8实验结果显示，U251细胞接种后1、2、3、4及5 d的细胞增殖率分别为(99.5±2.6)%、(236.7±4.7)%、(348.9±8.8)%、(656.5±18.5)%及(715.7±48.2)%；而U251-C1多倍体巨细胞的细胞增殖率分别为(100.6±2.1)%、(114.5±1.3)%、(138.4±1.7)%、(316.7±23.1)%及(347.7±13.1)%，U251-C2多倍体巨细胞的细胞增殖率分别为(100.3±1.2)%、(114.7±1.2)%、(186.4±0.6)%、(307.1±9.5)%及(432.9±37.7)%，相较于胶质瘤U251细胞，U251多倍体巨细胞的不同克隆株(U251-C1、U251-C2)的增殖速度均明显减慢(均P<0.05)。替莫唑胺作用下，U251细胞和U251多倍体巨细胞(U251-C1、U251-C2)的细胞存活率均下降(均P<0.01)，而与U251细胞组比较，不同U251多倍体巨细胞株(U251-C1、U251-C2)的细胞存活率均更高(均P<0.01)。结论植物血凝素-聚乙二醇细胞融合法可在体外成功构建脑胶质瘤U251多倍体巨细胞；胶质瘤U251多倍体巨细胞可能对替莫唑胺的耐药性发挥重要作用。