简介:以油茶湘林4号为材料,通过RT-PCR和RACE的方法克隆出油茶磷酸转运子Pht1基因家族一个成员的全长cD-NA序列,命名为CoPht1;1(GenBank登录号:JX403969),通过实时定量PCR的方法检测了不同磷浓度下该基因在根系中的表达水平。结果表明:CoPht1;1CDS长度为1626bp,编码542个氨基酸,与其他物种的Pht1氨基酸序列具有较高的相似性,其中与夹竹桃科长春花的Pht1相似性最高,达到88%;蛋白质二级结构和拓扑结构预测表明,CoPht1;1具有跨膜蛋白的主要特征,与其他物种的Pht1具有一致性;实时定量RT-PCR结果表明,油茶Pht1基因的表达受低磷诱导,并在受磷胁迫处理(P浓度为0.1mmol/L)15d时表达量最高。
简介:FLOWERINGLOCUSD(FLD)是植物自主开花途径花发育基因,在植物营养生长向生殖生长转变的过程中起重要的调控作用。本研究利用同源基因克隆法结合RACE技术克隆了蜻蜒凤梨似echme口触ciat曲花发育基因FLD的类似基因AfFLD。序列分析比对表明,AfFLD所推测的氨基酸序列包含有LSDl-LIKE亚家族两个高度保守的结构域:SWIRM结构域和胺氧化酶结构域,该蛋白与玉米、拟南芥的FLD蛋白的同源性分别为72%3N73%。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析了乙烯处理不同时间FLD基因的表达模式,结果表明乙烯处理不同时间的各组中,处理后1d时FLD的表达量达到最高值,其中表达量最高为0h的2.5倍。本结果为开花自主途径中相关基因对乙烯处理后的响应机理的研究提供理论基础。
简介:目的:在大肠杆菌中表达大鼠脊髓损伤与修复蛋白39(SCIRR39)的C端抗原表位,并制备其多克隆抗体。方法:从大鼠脊髓全横断损伤脊髓cDNA中扩增1386bp的Scirr39基因编码框,亚克隆该基因编码蛋白C端359~461位氨基酸残基的DNA片段,插入表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达情况,切胶纯化目的蛋白;利用多克隆抗体制备技术,制备重组SCIRR39蛋白的多克隆抗体;用ELISA方法检测抗体效价,Western印迹检测抗体的特异性。结果:SCIRR39蛋白C端抗原表位与GST的融合蛋白在大肠杆菌中以可溶形式高表达,相对分子质量为37.9×103;获得抗SCIRR39蛋白C端抗原表位的兔抗血清,其效价达到1:104;Western印迹显示多克隆抗体能特异识别重组SCIRR39蛋白的C端抗原表位。结论:在原核系统中表达纯化了重组SCIRR39抗原表位蛋白,制备的重组蛋白多克隆抗体将用于检测SCIRR39在脊髓损伤过程中的表达变化。
简介:细胞凋亡是调控机体发育和维护内环境稳定的重要机制。在克隆了稀有鮈鲫(Gobiocyprisrarus)肝脏组织中凋亡相关的bcl-2、apaf-1、caspase-3和caspase-9基因的部分cDNA片段之后,进行了序列分析。结果表明,caspase-3和caspase-9基因片段与唐鱼(Tanichthysalbonubes)相对应的核苷酸序列同源性最高,而bcl-2、apaf-1基因片段则分别与鮈鱼(Gobiogobio)和鲤鱼(Cyprinuscarpio)相对应的核苷酸序列同源性最高,为99%和89%。基于稀有鮈鲫和已知物种的caspase-3基因核苷酸序列构建了系统发育树,发现稀有鮈鲫与唐鱼、斑马鱼(Daniorerio)的亲缘关系最近,而与金头鲷(Sparusaurata)、红鳍东方鲀(Takifugurubripes)的亲缘关系较远。本研究为深入理解外源性化学物质对鱼类的毒理学机制及其生态健康风险评价提供科学数据,同时也为稀有鮈鲫在鲤科鱼类的分类及进化地位的研究提供分子水平的重要参考。
简介:目的:克隆并表达caspase-8/10相关RING结构域蛋白1(CARP1)基因,检测其泛素连接酶活性。方法:提取结肠癌HCT116细胞总RNA,RT-PCR扩增CARP1基因,将其克隆到真核表达载体pcDNA3-Flag中,序列正确的阳性克隆进行扩增,提取质粒转染至293T细胞中进行瞬时表达,通过体内泛素化检测其泛素化酶活性,通过萤光素酶报告基因的方法检测其对NF-kB转录活性的影响,利用细胞生长曲线检测CARP1基因对结肠癌细胞生长的影响。结果:免疫印迹实验表明CARP1基因在293T细胞中获得有效表达;免疫共沉淀实验表明,当CARP1存在时,受体相互作用蛋白1(RIP1)被泛素化;萤光素酶实验结果表明CARP1抑制肿瘤坏死因子a(TNFa)引起的NF-kB报道基因的激活;通过生长曲线发现CARP1能促进结肠癌细胞系HCT116生长,并能部分抵抗顺铂抑制细胞生长的作用。结论:构建的人CARP1基因真核表达载体在293T细胞中获得表达,表达产物具有RIP1泛素连接酶的活性,可抑制TNFa引起的NF-kB报告基因的激活,并且促进结肠癌细胞的生长,为进一步的基因功能研究奠定了基础。