简介:为了探明CBF转录因子在扁桃中的抗寒分子机理,以新疆栽培扁桃‘矮丰’叶片为材料,通过PCR技术从扁桃基因组DNA中获得CBF1转录因子,命名为AF-PdCBF1,GenBank登录号为KM245570。序列分析表明,该基因开放阅读框为729bp,编码242个氨基酸,推测蛋白质分子量为27.405kD,并且该蛋白没有信号肽。进化树分析表明,AF-PdCBF1与甜樱桃和中国梅的亲缘关系最近。将该基因片段连接到原核表达载体pET-32a(+)中,构建融合表达质粒pET-PdCBF1,转化到E.coliRosetta(DE3)中进行表达。SDS-PAGE电泳检测结果表明,表达蛋白与预期大小一致,分子量大小约为47.8kD。对重组蛋白的诱导条件进行优化后结果表明,重组蛋白pET-PdCBF1在IPTG浓度为0.2mmol/L、诱导4h时,其表达量最佳。试验结果可为进一步纯化和鉴定目的蛋白及研究其功能奠定基础。
简介:目的:探讨Ca2+和Na+诱导细胞凋亡的最佳浓度及时间,并用甲基绿一派诺宁染色法检测凋亡细胞的形态变化。方法:分别用不同浓度梯度及时间梯度的Ca2+和Na+胁迫处理洋葱鳞茎内表皮细胞,得诱导的最佳浓度及时间;用甲基绿一派诺宁染色法检测诱导凋亡的洋葱鳞茎内表皮细胞、大蒜根尖细胞和鸡血红细胞的形态特征变化。结果:诱导处理的最佳Ca2+和Na+浓度为0.4mol/L,最适时间约为8h,且CaCl2的诱导效果较NaCl好;经甲基绿一派诺宁染色,洋葱鳞茎内表皮细胞、大蒜根尖细胞、鸡血红细胞凋亡细胞的细胞核均呈蓝紫色,细胞质呈红色。结论:找出了诱导细胞凋亡的最适Ca2+和Na+浓度和时间,并检测到细胞凋亡。
简介:目的:通过对TRIzol一步法进行改进,建立一种从富含胶原蛋白、多糖及色素的仿刺参体壁提取总RNA的有效方法。方法:样品在液氮中研磨并用TRIzol匀浆后再进行抽提;对TRIzol一步法提取的总RNA进行DNaseⅠ消化和酚氯仿抽提,用2.5mol/L的醋酸钾沉淀,并加入适量糖原(10mg/mL)与RNA共沉淀。结果:琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法以及RT-PCR检测结果表明,改进的方法能够有效去除基因组DNA、蛋白、多糖及色素的污染,RNA的产率提高。结论:制备的总RNA纯度高,完整性好,能够满足mRNA差异显示RT-PCR等分子生物学研究的要求,是一种提取仿刺参体壁及其他富含黏多糖、胶原蛋白和色素的动物组织总RNA的有效方法。