简介：为了进一步明确苹果茎痘病毒（Applestempittingvirus,ASPV）的分子变异及株系分化,制备相应特异性抗血清。本研究以库尔勒地区种植的感染ASPV的鸭梨（Y）枝条韧皮部为试材,采用RT-PCR技术扩增ASPVCP基因,克隆、测序,获得了鸭梨分离物外壳蛋白（ASVPCP-Y）基因,将该CP基因连接到表达载体PET-28a上,转化到大肠杆菌BL21（DE3）,1mmol/LIPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析。研究结果表明,获得的鸭梨ASPVCP基因全长1194bp,推测编码397个氨基酸,与已报道的ASPV分离物的氨基酸序列同源性为70%左右。进化分析结果显示,ASPVCP基因的分离物可聚为三个类群：第一类群的寄主为苹果,第二类群的寄主为梨（除了NC_003462,苹果）,ASPVCP-Y归入第三类群。CP基因在大肠杆菌中诱导表达,其融合蛋白分子量约为42kD。克隆的鸭梨ASPVCP基因及构建的原核表达载体为制备ASPV重组CP基因多克隆抗体及ASPV的分子生物学的进一步研究奠定了基础。

简介：丝氨酸乙酰转移酶(serineacetyltransferase,SAT)是甲硫氨酸和半胱氨酸合成途径的关键酶,利用该基因提高作物中甲硫氨酸水平具有广阔的应用前景。为了研究拟南芥SAT1(ArabidopsisthalianaSAT1)基因的蛋白表达情况及相关功能,构建了带有His标签的AtSAT1基因原核表达载体pET-30b(+)-SAT1-His(6)。将其导入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,经固定化金属离子亲和层析(IMAC)纯化获得了抗原蛋白SAT1-His(6)。该抗原蛋白经免疫兔子,成功制备了具有较高特异性和灵敏性的SAT1蛋白多克隆抗体。Westernblotting表明,该抗体可用来检测转AtSAT1基因的转基因玉米株系中SAT1蛋白的积累量,为后期对该基因开展进一步深入研究具有重要意义。

简介：橡胶树起源热带雨林,对低温敏感。在中国橡胶树（Heveabrasiliensis）种植受到严重的低温胁迫影响,而CBF/DREB1（C-repeatbindingfactor/dehydrationresponsiveelementbindingfactor1）是低温信号通路中重要的转录因子,但目前橡胶树中仅克隆到HbCBF1。本研究从橡胶树中克隆出两个新的CBF家族基因HbCBF2和HbCBF3。经测序,HbCBF2和HbCBF3分别编码了234个和242个氨基酸。氨基酸序列分析表明HbCBF2和HbCBF3均含有CBF家族特有两个短肽序列包括一个保守的DNA结合结构域和NLS簇。通过构建进化树发现HbCBF2、HbCBF3与HbCBF1以及拟南芥中的CBF序列同源性很高。将HbCBF2和HbCBF3构建到pGEX4T-1原核表达载体上,在Transetta（DE3）中进行表达。SDS-PAGE电泳检测它们蛋白质表达量为51.8kD和53kD,与预期一致。对蛋白的诱导条件进行优化,构建融合表达质粒pGEX4T-1-CBF2和pGEX4T-1-CBF3,在28℃、IPTG浓度为0.4mmol/L的情况下表达量最佳。实验为纯化蛋白和研究HbCBF2和HbCBF3在橡胶树中的功能提供理论帮助。

简介：紫外线B(UV-B)对于植物生长发育具有重要调节作用,其中UVRESISTANCELOCUS8蛋白作为UV-B的光受体在植物响应UV-B过程中起关键作用。草莓是一种重要的经济果树,目前关于草莓的UV-B光受体报道较少。为研究草莓中UV-B受体蛋白,本研究采用同源克隆的方法获得‘丰香’草莓中编码UV-B光受体蛋白的cDNA序列,进行了生物信息学的分析并构建了原核生物表达载体pET32a-UVR8,利用中心点响应面法优化了重组蛋白的诱导条件(包括诱导温度,IPTG浓度,菌液浓度和诱导时间)。结果表明:克隆得到了编码草莓UVR8蛋白的全长cDNA序列,命名为FaUVR8,生物信息学分析表明该序列长1317bp,编码438个氨基酸,预测分子量为47.28kD,等电点pI为5.85,重建蛋白质三维结构表明该蛋白包含7个β-片状螺旋结构;原核表达得到69.7kD的融合蛋白,对四个诱导条件优化表明将工程菌培养至菌液OD600=0.7,加入浓度为0.55mmol/L的IPTG,在27.72℃下诱导9h,可获得最大量重组蛋白79μg/mL。研究结果可为后期寻找与FaUVR8蛋白互作的下游蛋白,以及进一步开展其功能研究提供参考。

简介：本研究应用ISSR和SSR技术建立了24个水稻光温敏核不育系的DNA指纹图谱,利用13个ISSR引物和20对SSR引物,分别获得174个多态性片段和62个多态性片段,平均每个ISSR引物检测到13.38个多态性片段,远远高于SSR引物的检测率.根据遗传距离进行的聚类分析表明,利用这两种标记所得的聚类结果十分相似,24个材料被聚为粳型,偏籼型和籼型三个类群,在籼型不育系类群内,又可明显的分成三个亚类群,其中7个安农S-1衍生的不育系聚为一类,与农垦58S衍生的不育系有明显的遗传差异.根据两种标记计算的遗传距离及其遗传关系,所得的结果仍有一些差异,但总体趋势是一致.研究结果表明,ISSR和SSR标记适用于构建DNA指纹图谱,进行分类鉴定和遗传分析.

简介：基于转基因作物的安全性考虑,在用于转化的表达载体上除了含有目的基因以及控制该目的基因表达的启动子和终止子外,最好不存在其它有可能存在安全性争议的DNA序列,由此培育的转基因植物可能将更易于被消费者所接受。本研究以pCAMBIA1300载体为基础,基因操作去除pCAMBIA1300质粒上的潮霉素抗性基因和花椰菜花叶病毒的35S启动子序列,构建了两种只含有水稻蜡质基因启动子引导蜡质基因反义片段的表达载体,p13AWY-1和p13AWY-2。其中p13AWY-1表达载体含有一个由水稻蜡质基因启动子、第一内含子、反义蜡质基因（Waxypro＋intron1＋anti-Waxy）的融合基因单元;而p13AWY-2表达载体含有两个正向排列的Waxypro＋intron1＋anti-Waxy融合基因单元。我们通过构建水稻反义蜡质基因安全性表达载体,试图为植物安全性表达载体的构建提供一种思路,为今后大规模商业化采用转基因技术改良农作物遗传特性提供安全的转基因方法。

简介：NAC转录因子在植物逆境应答中具有重要的作用。本研究从番茄中克隆了一个NAC基因SlNAC71。该基因编码区长1059bp,编码352个氨基酸,预测分子量约为39.51kD,等电点为8.40。推测的氨基酸序列中含有1个高度保守的NAM结构域。SlNAC71基因序列具有miR164靶序列识别位点。亚细胞定位预测SlNAC71蛋白定位于细胞核。进化树分析发现,SlNAC71和AtNAC分为一个分支。组织特异性表达模式分析表明在检测的所有组织中SlNAC71都有表达,在叶中表达量最高,在茎中表达量最低。SlNAC71基因的表达受高盐诱导,说明番茄SlNAC71基因可能参与番茄对高盐胁迫的应答。

简介：本研究通过3年4环境的田间试验,在BIL（backcrossinbredlines）群体中选取断裂比强度最大的材料NMGA-062（32.5cN/tex）和断裂比强度最小的材料NMGA-144（26.67cN/tex）,利用Affymetrix棉花基因芯片,比较分析NMGA-062和NMGA-144纤维发育10d时的基因表达谱。在24029条转录本中,两个基因型中差异表达的转录本6504条,占筛选转录本总数的27.07%;其中差异表达倍数在2倍或2倍以上的转录本有3461条,占筛选转录本总数的14.41%,对其进行功能分类。对8个差异表达明显的基因（Ghi.10655.1.S1_s_at,ACO1,ARF1,SAHH,TUA6,TUA7,β-tub1,β-tub10）进行实时荧光定量PCR的检测,发现表达模式均与芯片结果一致,说明芯片数据具有生物学意义上的可重复性,结果是可信的。本研究为以后克隆及功能验证纤维发育相关基因提供了重要参考。

简介：FLOWERINGLOCUSD（FLD）是植物自主开花途径花发育基因，在植物营养生长向生殖生长转变的过程中起重要的调控作用。本研究利用同源基因克隆法结合RACE技术克隆了蜻蜒凤梨似echme口触ciat曲花发育基因FLD的类似基因AfFLD。序列分析比对表明，AfFLD所推测的氨基酸序列包含有LSDl-LIKE亚家族两个高度保守的结构域：SWIRM结构域和胺氧化酶结构域，该蛋白与玉米、拟南芥的FLD蛋白的同源性分别为72％3N73％。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术分析了乙烯处理不同时间FLD基因的表达模式，结果表明乙烯处理不同时间的各组中，处理后1d时FLD的表达量达到最高值，其中表达量最高为0h的2．5倍。本结果为开花自主途径中相关基因对乙烯处理后的响应机理的研究提供理论基础。

简介：利用转sck基因高代稳定水稻亲本和组合为材料,研究了外源sck基因的遗传表达特性。结果表明：外源sck和hpt基因都能自交连锁稳定遗传到T11并表达,且连锁基因和表达活性可杂交转移到不育系和杂交组合中,外源sck基因在杂种F2代以单基因显性遗传3：1的模式进行分离,但也出现自交hpt基因丢失,杂交hpt基因甚至sck基因未获得成功转移的现象。田间抗虫性观测表明,转sck基因水稻对钻蛀性螟虫抗性不足,对卷叶螟具有一定抑制作用。外源sck基因在转化或杂交转育的亲本及组合中均获得表达,且具有一定的空间分布特性和基因累加效应,基本为叶片的表达活性高于叶鞘。

简介：农杆菌渗入法是在植物中瞬时表达外源基因的一种方法,该方法通过在植物叶片上注射农杆菌,使目的基因转入植物细胞中进行快速表达。本文综述了农杆菌渗入法的原理、技术流程、影响因素及其应用,其应用主要涉及外源基因的表达、检测转基因的表达、启动子分析、转录后基因沉默、抑制子功能鉴定、细胞定位以及基因相互作用等方面。随着技术的进一步完善,我们相信该技术将成为转基因育种领域的重要的手段。

简介：利用生物信息学手段，结合公共大豆基因组数据库和大豆发育表达芯片数据获得大豆GST家族基因序列、蛋白序列和染色体位置等信息并进一步对基因的组织表达等进行分析。结果显示大豆中含94个GST家族基因，根据系统发育分析将这些GST基因分成5个亚家族；定位分析表明，94个GST基因分布于大豆的16条染色体上。表达分析结果表明，14个不同发育阶段，大多成员至少在一个组织中表达，11差异表达的基因中有7在根中表达，另外4在其它部位优势表达，基因表达具有一定特异性。本研究为进一步研究GST家族的功能及其抗逆利用提供基础。

简介：本研究对聚乙二醇（polyethyleneglycol,PEG）的分子量、浓度及处理时间等三个影响番木瓜叶肉原生质体转化效率的主要因素进行了优化，同时利用绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein,GFP）表达体系进行了转化表达分析。结果表明：经40%PEG8000溶液处理10min，可使GFP在原生质体中的平均转化率达到45.26%；沉默抑制载体pGreen-Hcpro和GFP瞬时表达载体共转化番木瓜叶肉原生质体，可使GFP在原生质体中的平均转化率进一步提高到68.75%，相比单独转化瞬时表达载体pRNAi-GFP增长了51.90%。PEG介导番木瓜叶肉原生质体瞬时表达体系的建立为番木瓜功能基因组和基因功能研究奠定了基础，可为热带作物的研究提供又一模式作物，推动热带作物在分子及细胞生物学领域的发展。

简介：FT被认为是汇集各个开花途径的关键因子,其超量表达可促进植物提早开花。本研究通过RT-PCR方法,以纽荷尔脐橙(Citrussinensis(L.)Osbeck)叶片为材料,成功地克隆到了2个FT基因的cDNA序列,分别为534bp和537bp,各自编码177个和178个氨基酸,并对其进行了生物信息学相关分析。荧光定量分析了2个CsFT基因在脐橙不同器官的表达情况,结果表明二者在果皮、果肉、茎、叶、花中均有表达,但CsFT1基因在果肉中的表达量最高,CsFT2基因在叶中的表达量最高;这2个基因在不同花器官中均有表达,CsFT1基因在花瓣中表达最高,CsFT2基因雌蕊中表达最高,并都在开花后第7天的花器官中达到最大,随后下降。将2个基因连接到植物表达载体pCAMBIA1301上,得到了过量表达载体pCAMBIA1301-35S-CsFT1和pCAMBIA1301-35S-CsFT2,并成功转化农杆菌,为下一步转化柑橘获得转基因植株提供了技术参考。

简介：本研究对基因枪导入了pBAC128F／R质粒（含有玉米Adh1内含子1的CaMV35S启动子驱动的bar基因作为选择标记，以来自拟南芥菜逆境诱导表达类型——亲水蛋白rd29b基因的启动子驱动脱水应答转录因子DREB1B基因的逆境诱导表达类型质粒）的T4代转基因小麦进行了稳定表达研究。PCR、PCR—Southern和Southern杂交分析表明，外源转录因子DREB1B基因已稳定整合到转基因株系的基因组中。半定量RT—PCR结果表明，部分转基因株系的DREB1B基因的相对表达量有所增强。叶片除草剂抗性检测结果显示有8个转基因株系可抗到150mg／L。叶片脯氨酸含量测定结果表明，有4个株系（编号为1，18，30和76）的脯氨酸含量提高幅度较大，同一株系，干旱与未干旱处理相比，脯氨酸含量提高了3～5倍。干旱处理后的转基因植株与非转基因植株相比，脯氨酸含量高2～3倍。在干旱条件下，T4代田间小区产量统计数据分析结果表明，有4个转基因株系（编号为30，51，70和76）的产量与非转基因植株相比有显著增加。研究表明，利用逆境诱导型rd29b基因的启动子来增强外源DREB1B基因的表达，能显著改良小麦的抗旱性。

简介：本研究以油茶品种‘长林4号’无性系扦插苗为材料,采用RT-PCR技术分离出一个油茶铝激活苹果酸转运体基因。该基因的cDNA全长1761bp,编码586个氨基酸,分子量为65.59kD,理论等电点(PI)为6.27。与其他植物的ALMT蛋白高度同源,将该基因命名为CoALMT(GenBank登录号:KT932706)。CoALMT蛋白含有6个跨膜区,可能定位在细胞质膜上。CoALMT蛋白二级结构中α-螺旋(Alphahelix)、β折叠(Extendedstrand)、β转角(Betaturn)、无规则卷曲(Randomcoil)分别占52.05%、16.89%、8.70%、22.35%。以‘长林4号’和‘长林166号’无性系扦插苗为材料,利用qRT-PCR技术分析了沙培条件下两个不同无性系在不同磷水平下不同器官组织中CoALMT基因的表达。结果表明,低磷处理下,两个无性系油茶根系CoALMT的表达量均上升,说明油茶根系中CoALMT基因的表达受到低磷诱导。茎和叶中的表达模式与根中存在差异。低磷处理下不同组织中,‘长林166号’中CoALMT基因的表达量均比‘长林4号’高。综上结果可知CoALMT基因参与油茶对低磷的响应,其可能会影响油茶的磷吸收与利用效率。

简介：以前期获得的紫苏HPPR基因的cDNA序列为模板,通过设计特异性引物和染色体步移的方法分离出HPPR基因启动子,全长2216bp,以此研究HPPR基因启动子的结构及功能特点。生物信息学分析表明,该序列中存在TATA-box和CAAT-box等典型的真核生物启动子基本元件,以及对茉莉酸甲酯、生长素、水杨酸和脱落酸等植物激素应答相关的顺式作用元件,另外也存在非生物胁迫顺式作用元件。将HPPR启动子部分缺失序列替代pBI121载体中的CaMV35S启动子,构建了与GUS融合的启动子元件缺失表达载体。本试验的研究为该启动子在今后紫苏转基因定向改良提供了有用的候选资源。

简介：目前，在铁皮石斛多糖的研究主要集中在多糖的结构、生物活性等方面，对多糖合成相关基因研究较少，本研究通过对‘红鑫1号’铁皮石斛幼苗期和二年生植株以及‘红鑫6号’铁皮石斛二年生植株叶、茎、根三部位蔗糖合成酶基因进行RT-PCR扩增与测序，发现‘红鑫1号’与‘红鑫6号’铁皮石斛的蔗糖合成酶前体mRNA存在拼接差异的现象，主要形成三种不同的mRNA转录本，其翻译得到的蔗糖合成酶，结构功能没有改变；分析序列的可变剪切的差异；同时对铁皮石斛叶、茎、根嬲的表达量进行半定量RT-PCR检测，蔗糖合成酶基因在植株中不同部位表达量不同，其表达模式表现为茎〉叶〉根。本研究为铁皮石斛蔗糖合成酶基因功能研究提供了科学依据。

简介：为预防小反刍兽疫,生产稳定高效的小反刍兽疫植物疫苗,本研究以小反刍兽疫病毒(PPRV)的F基因为目的基因,以pBI121为基本表达载体,绿色荧光蛋白基因(GFP基因)为标记基因,并通过添加核基质附着区序列(MAR序列)、驻内质网膜信号序列(KDEL序列),使用强启动子CsVMV替换启动子CaMV35S,以期使F基因在苜蓿中能够高效表达,并最终实现预防小反刍兽疫的目的。本实验最终成功构建了五条载体:pBI121-CsVMV-GFP-F-MAR12-MAR34、pBI121-CsVMV-GFP-F-KDEL-MAR12-MAR34、pBI121-CsVMVF-MAR12-MAR34、pBI121-CsVMV-F-KDEL-MAR12-MAR34、pBI121-F。

简介：木薯是世界第三大薯类作物,所产淀粉广泛用作食品和工业原料,是重要的粮食和经济作物。木薯蔗糖合酶是将光合同化物蔗糖向淀粉转化的第一个关键酶,前期本课题组通过酵母单杂交分析发现αNAC可能是木薯蔗糖合酶Ⅰ基因的调控因子,本研究在此基础上获得了αNAC基因转录序列并克隆其编码序列,发现编码蛋白具有典型的NAC和UBA保守结构域。αNAC基因在木薯地上部叶和地下部块根肉中转录活性较高,为β-actin基因的5%~25%,在施用外源激素条件下转录活性显著上调,其中茉莉酸达到峰值时间最短,水杨酸次之,乙烯、脱落酸、赤霉素和生长素较长。此外,在MeSuSy1Promoter::GUS的转化株中二次过表达αNAC基因,发现二次转化株中GUS酶活显著低于单价转化株,表明过表达αNAC基因可以显著抑制木薯蔗糖合酶Ⅰ基因的转录活性。