简介：摘要目的建立一种人星状病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR(real-time reverse transcription-polymerase chain reaction)快速检测方法。方法根据人星状病毒ORF1b基因的保守序列设计扩增引物和特异性荧光探针，建立星状病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR快速检测方法，并对该方法的特异性、灵敏度和稳定性进行评价，同时应用该方法对实际临床样本中的星状病毒进行检测。结果所建立的人星状病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法具有良好的特异性和稳定性，灵敏度可达102拷贝/μl，对星状病毒临床样本检测后，检出率达100%。结论本文所建立的人星状病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR法具有简单快速、灵敏度高、特异性强、稳定性好的特点，可应用于临床星状病毒的病原检测和流行病学调查。

简介：摘要目的建立武乡病毒(wuxiang virus, WUXV)的实时荧光定量TaqMan反转录聚合酶链式反应(real-time RT-PCR)检测方法。方法从GenBank中下载WUXV的全部基因序列，使用MEGA-X完成多序列比对分析，选择针对S段基因高保守区设计的引物和探针，分别对检测反应的特异性、灵敏性和稳定性进行评价。结果建立的方法可以特异性地检测WUXV，并且与多种虫媒病毒无交叉反应；反应的灵敏度较高，最低检测下限为1 pfu/ml；同一样品重复检测循环阈值(Ct)的批间变异系数均小于1.00%；用本研究建立的TaqMan RT-PCR检测30批白蛉核酸样本，其中7批出现WUXV阳性扩增曲线。结论本研究建立了灵敏度高、特异性强、重复性好的TaqMan RT-PCR方法可用于WUXV的大批量样本筛查。

简介：摘要目的建立针对发热伴血小板减少综合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus，SFTSV)、登革病毒(dengue virus, DENV)、汉滩病毒(hantaan virus，HTNV)三种常见病毒性出血热病毒的现场应急快速检测方法。方法基于传统的TaqMan荧光探针技术，利用国产快速一步法RT-PCR试剂盒，结合magnetic induction cycler (Mic) qPCR仪，建立三种常见病毒性出血热病毒的快速荧光定量RT-PCR检测方法。利用三种病毒体外转录RNA及模拟样本、其他相关病毒临床样本及健康人血标本进行灵敏度、特异性、重复性验证。结果相较于传统的实时荧光定量RT-PCR方法，此方法所需时间大大缩短，可在35 min内完成检测。SFTSV、DENV、HTNV的最低检出限均小于100拷贝/PCR，与模拟对照样本及其他病毒临床样本无交叉反应，模拟阳性样本验证均可检出，且各组验证结果的Ct值变异系数均小于4%。结论本研究建立的快速荧光定量RT-PCR检测方法具有良好的灵敏性、特异性和重复性。对于现场应急检测和媒介生物标本筛查具有一定的应用前景。

简介：摘要目的探讨实时荧光RT-PCR方法检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸在疾病诊断中的应用。方法从中国疾病预防控制信息系统选取截至2020年3月5日录入的河南省COVID-19的实验室检测数据和病例基本信息。所有信息都由当地医院和疾控中心录入系统，医院或者区县疾控中心负责采样，河南省各省辖市疾控中心负责核酸检测。结果共纳入6 714份标本，SARS-CoV-2核酸检测阳性率为23.82%。标本来源于3种诊断类型，确诊病例1 200例，疑似病例2 178例，无症状感染者77例，SARS-CoV-2感染核酸确诊率为36.96%(1 277/3 455)。所有诊断类型标本中，鼻拭子、痰液和咽拭子的SARS-CoV-2核酸检测阳性率分别为19.38%、28.59%、23.53%，差异有统计学意义(χ2＝15.896，P<0.01)。确诊病例的呼吸道标本SARS-CoV-2核酸检测阳性率为63.10%。鼻拭子、痰液和咽拭子的核酸阳性率分别为50.80%、58.71%、65.21%，差异有统计学意义(χ2＝18.612，P<0.01)。所有诊断类型发病后当天、1周、2周、3周、4周和5周及5周以上呼吸道标本SARS-CoV-2核酸检测阳性率依次为43.51%、23.98%、22.82%、12.17%、14.46%、13.21%，在确诊病例中的阳性率依次为89.03%、86.57%、52.30%、17.53%、17.69%和24.14%。结论实时荧光RT-PCR方法检测SARS-CoV-2核酸是最有效的早期病原学诊断方式，COVID-19发病后1周内核酸检出率最高，核酸检出时间最晚是发病后38 d。

简介：摘要目的利用Y型引物和荧光定量RT-PCR技术建立一种用于登革病毒(dengus virus, DENV)快速分型的四重荧光定量RT-PCR检测方法。方法用DENV四种分型体外转录RNA对该方法的灵敏度、特异性进行评价及用临床样本进行验证。结果DENVⅠ型、Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型最低检出限分别为5.01反应/PCR、6.16拷贝/反应、6.35拷贝/反应、6.39拷贝/反应，与单重实时荧光定量RT-PCR比，最低检测限无明显变化；且与其他病毒无交叉反应，临床标本的阳性一致率和阴性一致率均为100%。结论本研究建立的Y型引物四重荧光定量RT-PCR方法可有效避免不同DENV分型间的交叉反应，同时具有良好的灵敏度和特异性，可用于相关临床标本的DENV快速分型检测。

简介：摘要目的利用多重荧光逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析急性下呼吸道感染患儿4种病毒：人腺病毒(HADV)、人博卡病毒(HBoV)、人偏肺病毒(HMPV)、人呼吸道合胞病毒(HRSV)的感染情况。方法收集1 045例急性呼吸道感染的住院患儿鼻咽深部分泌物标本，采用多重荧光RT-PCR进行呼吸道病毒4项指标检测，就病毒分布情况、季节因素等方面进行临床流行病学特点分析。结果1 045例患儿中有281例4种呼吸道病毒阳性，总阳性率为26.89%；其中单一病毒感染194例(69.04%)、混合病毒感染87例(30.96%)，HMPV感染最多，为120例(42.70%)、其次为HRSV感染119例(42.35%)；在各年龄组中≤3岁组阳性229例(36.06%)，4～7岁组阳性114例(42.22%)，≥8岁组阳性63例(45.00%)。从季节分布来看，春、夏、秋、冬四季的检出率分别为25.68%、28.24%、49.34%、65.57%。结论多重荧光RT-PCR法能快速检测乌鲁木齐地区儿童急性呼吸道病毒，呼吸道病毒感染主要为HMPV和HRSV感染；呼吸道病毒患儿感染率最高年龄段为≥8岁；以秋季和冬季为呼吸道病毒感染高发期。

简介：摘要目的建立可以检测阿瓦朗病毒(Avalon virus，AVAV)和休斯病毒(Hughes virus，HUGV)两种内罗病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法，并进行初步的评价。方法收集、整理、比对、分析在公共数据库发布的两种病毒基因组核苷酸序列，确定检测靶标，设计特异性引物、探针，优化检测程序，建立实时荧光定量RT-PCR检测方法。利用体外转录技术制备的模拟样本、其他病毒感染标本、病毒株和正常人血标本比较评价所建方法的检测限、特异性、重复性特征。结果所建实时荧光定量RT-PCR检测方法可有效扩增检测AVAV和HUGA靶标RNA，检测限分别约为20拷贝/μl和70拷贝/μl，检测科萨努尔森林病毒、乙型流感病毒BV和BY型、甲型流感病毒H3N2、黄热病毒、乙型脑炎病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、发热伴血小板减少综合征、内罗毕羊病毒和塔西那病毒样本无非特异性扩增，两种内罗病毒相互间无交叉反应，重复性比较分析显示变异系数小于2%。结论本研究建立的检测AVAV和HUGV的实时荧光定量RT-PCR方法，可用于临床样本检测和媒介生物、宿主动物标本筛查，便于病原的快速识别和疾病诊断。

简介：无

简介：摘要目的了解宁波市儿童呼吸道感染病原体的流行特征，为临床防控和诊治提供参考依据。方法收集2019年7～10月份间宁波市妇女儿童医院就诊急性呼吸道感染患儿的标本共3 103例，通过基于毛细电泳的多重RT-PCR法检测常见的13种呼吸道病原体，并对结果进行统计分析。结果3 103例患儿中2 053例呼吸道病原体检测阳性，总阳性率为66.16%。检出率前3位分别为肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae, Mp)33.19%(1 030/3 103)、鼻病毒(human rhinovirus, HRV)24.20%(751/3 103)和腺病毒(human adenovirus, HADV)8.77%(272/3 103)。病原体在男性患儿和女性患儿中的检出率分别为65.70%(1 157/1 761)和66.77%(896/1 342)，差异无统计学意义(χ2＝0.386, P＝0.535)；在年龄≤1岁组、1～≤3岁组、3～≤6岁组和6～≤16岁组检出率分别为58.02%(626/1 079)、74.37%(589/792)、73.78%(543/736)和59.48%(295/496)，组间差异具有统计学意义(χ2＝84.770, P＝0.000)；7～10月份检出率依次为71.64%(341/476)、68.81%(536/779)、67.01%(648/967)和59.93%(528/881)，差异具有统计学意义(χ2＝24.395, P＝0.000)；单一感染率为52.30%(1 623/3 103)，2种及以上病原体混合感染率为13.86%(430/3 103)，其中以2种病原体混合感染多见。结论宁波市儿童呼吸道病原体检出以Mp和HRV为主，病原体检出率在不同年龄阶段和不同月份间存在一定差异。

简介：摘要目的结合微流控与荧光定量RT-PCR技术建立寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)、登革病毒(dengue virus，DENV)、黄热病毒(yellow fever virus，YFV)和基孔肯雅病毒(chikungunya virus，CHIKV)的快速核酸检测方法，以实现这4种病毒感染的快速诊断。方法以ZIKV的NS1基因、DENV和YFV的NS5基因以及CHIKV的E1基因作为靶序列设计4组特异性引物探针；用体外转录RNA评价方法的灵敏性；用其他病毒核酸评价方法的特异性；ZIKV、YFV、CHIKV检测方法采用模拟阳性样本，DENV检测方法采用临床患者标本进行验证，并与传统荧光定量RT-PCR检测方法进行比较。结果ZIKV、DENV、YFV、CHIKV4种方法的最低检出限分别是14.57拷贝/μl、94.27拷贝/μl、8.25拷贝/μl、223.19拷贝/μl；4种检测方法与其他病毒核酸无交叉反应；ZIKV、YFV、CHIKV模拟阳性样本检出率为100%，各浓度检测Ct值的变异系数均在2%左右；20份DENV临床患者标本检出率为100%，与传统荧光定量RT-PCR检测方法结果一致。结论本研究建立的ZIKV、DENV、YFV、CHIKV微流控荧光定量RT-PCR检测方法具有良好的灵敏性、特异性、稳定性，25 min内即可完成1次检测，可适用于现场实验室检测与早期诊断。

简介：摘要目的比较四种商品化诺如病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒的效果。方法将美国疾控中心诺如病毒检测方法作为标准方法，使用4种商品化试剂盒对30份已知诺如病毒基因型阳性样本（5种GI和8种GII基因型）和50份腹泻患者粪便样本进行检测，对检测结果进行比较。同时对轮状病毒、星状病毒、肠道腺病毒和札如病毒进行特异性检测。结果30份已知基因型样本四种商品化试剂盒与标准方法均检测阳性。轮状病毒、星状病毒、肠道腺病毒和札如病毒检测阴性。试剂盒A、B、C、D和标准方法分别检测50份腹泻样本，检出率分别为52.0%（26/50）、46.0%（23/50）、50.0%（25/50）、48.0%（24/50）、54.0%（27/50）；试剂盒A、B、C、D与标准方法的一致性分别为96.3%、85.2%、92.6%和88.9%。试剂盒C的GI检测范围为104~108 copies/μL，GII检测范围为102~108 copies/μL。结论四种试剂盒均能检测本研究出现的诺如病毒基因型，试剂盒A和C检测效果优于试剂盒B和D。

简介：摘要目的应用实时荧光RT-PCR和半巢式RT-PCR方法检测和分析牡蛎中诺如病毒的基因特征。方法应用实时荧光RT-PCR和半巢式RT-PCR方法，对2014年11月至2015年10月北京市采集的新鲜市售牡蛎进行诺如病毒GⅠ/GⅡ组并联试验检测，分析检出率，应用符合率和一致性检验（Kappa值）对半巢式RT-PCR方法进行可靠性评价，应用半巢式RT-PCR方法扩增诺如病毒GⅠ/GⅡ衣壳蛋白区基因，对阳性产物进行测序。采用BioEdit 7.0.9.0软件进行序列比对、Mega 6.0软件构建进化树。结果72份样品中，实时荧光RT-PCR、半巢式RT-PCR和并联试验的诺如病毒检出率分别为31.94%（23/72）、38.89%（28/72）和48.61%（35/72）。2种方法符合率为73.61%，中度一致（Kappa值=0.43）。测序成功13株诺如病毒，11株（7株GⅡ.17、2株GⅡ.4 Sydney_2012、1株GⅡ.1和1株GⅡ.21基因型）为2种RT-PCR方法检测诺如病毒阳性样本所得；2株（GⅡ.17和GⅡ.3基因型各1株）为半巢式RT-PCR方法检测诺如病毒阳性样本、实时荧光RT-PCR方法检测诺如病毒阴性样本所得。这些毒株与腹泻患者、环境污水和贝类水产品参考株的相似性为84.4%~100.0%。结论用2种RT-PCR并联法检测牡蛎中诺如病毒，不仅能提高检出率还能获得更多基因型；牡蛎中诺如病毒毒株与人源、环境污水及贝类水产品参考毒株高度同源，应对经常接触牡蛎的人群及相关环境进行诺如病毒监测和防控。

简介：摘要目的建立一种可单管同时检测新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒和人源基因内标的一步法多重巢式荧光逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法。方法收集2020年2月至2022年2月广州白云机场海关入境人员新型冠状病毒核酸阳性样本30份和336份排查样本，以及2020年发生新型冠状病毒肺炎疫情前3年期间同样来自广州白云机场海关入境人员的其他呼吸道病原体阳性样本64份和呼吸疾病国家重点实验室提供的呼吸道病原体阳性毒株7份。选取新型冠状病毒 ORF和N基因，以及甲、乙型流感病毒M基因的核苷酸保守区域，设计和筛选出多重巢式荧光PCR引物和探针组合，同时引入人源基因内标的巢式扩增引物和探针，建立一套多重巢式荧光RT-PCR检测方法，应用制备的假病毒阳性质控品和样本盘，评估方法的敏感度、特异度，并进行临床样本应用性验证。结果所建立的一步法多重巢式荧光RT-PCR方法可特异性检出新型冠状病毒和甲、乙型流感病毒，新型冠状病毒的最低检出限约为125拷贝/ml，甲、乙型流感病毒的最低检出限约为250拷贝/ml；检测101份各类呼吸道病原体阳性样本，显示新型冠状病毒和甲、乙型流感病毒的检测敏感度分别为96.67%、92.86%和96.15%，三者的特异度均为100%，超过300份临床样本的应用性检测中，未见假阳性检出。结论建立了一套新型冠状病毒、甲、乙型流感病毒和人源基因内标的一步法多重巢式荧光RT-PCR方法，该方法具有良好的灵敏度和特异性，可用于新型冠状病毒和甲、乙型流感病毒的大批量样本快速筛查。

简介：AbstractFever and rash illnesses (FRIs) are a series of common diseases with fever and rashes as clinical manifestations, most of which are caused by viral infection. The rashes of FRIs are generally nonspecific; therefore it is difficult to identify FRI-associated viruses solely based on clinical symptoms. To achieve rapid and accurate identification of FRI pathogens, a multiplex one-step real-time reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) assay was developed and evaluated in this study. Primers and probes were selected for the detection of measles virus (MeV), rubella virus (RV), human enterovirus (EV), varicella-zoster virus (VZV), dengue virus (DENV), human parvovirus B19 (B19), Epstein-Barr virus (EBV), and human herpes virus 6 (HHV-6), which cover the most common pathogenic viruses of FRIs. Detection of the eight FRI-associated viruses, which was divided into two groups/tubes, was simultaneously performed under universal optimized reaction conditions in multiplex one-step real-time RT-PCR assay. The multiplex realtime RT-PCR showed high sensitivity and specificity in detecting the eight FRI-associated viruses. The limits of detection (LODs) for the eight viruses were in the range of 47–177 copies/reaction, and no cross reactions for the eight FRI-associated viruses were found in the multiplex assay. In addition, the results of the multiplex real-time RT-PCR assay were consistent with the results of a monoplex real-time RT-PCR assay and sequencing for clinical specimens obtained from FRI patients. With its advantages of high efficiency and rapid and accurate diagnosis, multiplex real-time RT-PCR was very feasible for the early diagnosis of FRI pathogenic viruses and would be of great help for the proper treatment, monitoring, and initiation of preventive measures for FRI cases.

简介：摘要病毒检测在病毒感染的预防、诊断、治疗及病毒性疫苗的质量控制等方面发挥着重要的作用。实时荧光定量PCR通过荧光信号实时检测目的基因扩增数量，是目前实验室最常用的的病毒检测技术，具有灵敏度高、检测快速、污染小等优点。此文对实时荧光定量PCR技术在病毒感染的快速诊断、病毒核酸定量检测和病毒型别的鉴定三个方面的应用进行阐述。

简介：摘要目的建立可检测杜贝病毒（dugbe virus，DUGV）、盖勒尤卜病毒（qalyub virus，QALV）和蒂亚福拉病毒（thiafora virus，TFAV）等三种内罗病毒基因组的实时荧光RT-PCR检测方法。方法收集、整理，比对、分析在公共数据库发布的三种病毒基因组S节段核苷酸序列，确定检测靶标，利用生物信息软件设计特异性引物、探针，优化检测程序，建立实时荧光定量RT-PCR检测方法，利用体外转录技术制备的模拟样本、其他病毒感染标本、病毒株和正常人血标本比较评价所建方法的检测限、特异性、重复性特征。结果所建实时荧光定量RT-PCR检测方法均可有效扩增检测病毒靶标RNA，检测限分别为160 copies/μL，20 copies/μL和10 copies/μL，检测科萨努尔森林病病毒、乙型流感病毒BV和BY型、甲型流感病毒H3N2、黄热病毒、乙型脑炎病毒、克里米亚-刚果出血热病毒和塔西那病毒样本无非特异性扩增，三种内罗病毒相互间无交叉反应，重复性分析显示变异系数均在2%以内。结论本研究建立的检测DUGV、QALV和TFAV的实时荧光RT-PCR方法，可用于相关临床样本、媒介、宿主动物标本以及进出口物品筛查检测。

简介：摘要目的建立并评价一种基于COYOTE® Flash20实时荧光定量PCR仪用于新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸快速检测的方法。方法通过使用靶向SARS-CoV-2 ORF1ab和N基因的特异性引物探针组构建快速反应体系，并验证体系的灵敏度和特异性。同时，使用108例新型冠状病毒肺炎(COVID-19)临床样本对该方法进行应用评估。结果该检测方法无需核酸提取、手动操作时间仅用1 min，样本进、结果出，可以在30 min完成检测。该方法最低检测限为4×102拷贝/ml；与其他人类冠状病毒(包括HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV)以及其他引起呼吸系统疾病的病毒无交叉反应。临床样本应用评估显示，与常规需要核酸提取的RT-qPCR的总符合率为98.15%。结论通过对SARS-CoV-2快速荧光定量PCR方法的应用评价发现，该方法操作简便、快速、特异、灵敏，适用于多种场景即时快速检测需求。

简介：摘要目的探讨即时荧光定量PCR（qPCR）法在检测石蜡包埋组织中结核杆菌的应用价值。方法回顾性分析湖北省十堰市太和医院病理科2017—2019年间1 213例用qPCR法检测过结核杆菌核酸的病例，将检测结果与石蜡切片抗酸染色及临床随访结果进行比较，验证其诊断价值。结果1 213例样本中，627例qPCR法检测结果为阳性，586例为阴性。临床随访证实其中876例为结核病，337例为其他疾病。经计算得出qPCR法的灵敏度为71.3%，特异度为99.4%，准确率为79.1%。这1 213例中892例有抗酸染色结果，其中阳性280例，阴性612例。结合临床诊断，抗酸染色的灵敏度为41.5%，特异度为99.5%，准确率为55.7%。结论与抗酸染色相比，qPCR法对石蜡包埋组织中结核分枝杆菌的检测有较高的灵敏度，有助于作出正确诊断。

简介：摘要目的对多重实时定量PCR(real-time quantitative PCR，qPCR)进行反应体系筛选和方法探索，使其用于G1—G4型轮状病毒VP7基因的快速分型和定量分析。方法设计G1—G4型轮状病毒VP7基因特异性引物和探针，以特异性体外转录RNA为模板，筛选多重qPCR反应体系，建立多重qPCR方法。采用单因素方差分析和配对样本t检验对多重与单重qPCR检测结果进行比较。结果经筛选，得到6组三重qPCR反应体系和1组四重qPCR反应体系。所建立的三重和四重qPCR中，除四重qPCR的G1型参数〔标准曲线决定系数(R2)为0.982、扩增效率为89.221%〕略低于要求外，其余标准曲线R2均>0.99，扩增效率均在90%至110%之间；检测灵敏度达102拷贝/μl。多重与单重qPCR检测同一样本的相关性较好(R2>0.95)。三重与单重qPCR(t值为1.420～25.786)、四重与单重qPCR(t值为2.505～4.851)检测结果间的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。结论建立的多重qPCR可同时对3种以上目的基因进行分型和定量检测，为未来多价轮状病毒疫苗及混合病毒样本中毒株的快速分型和定量检测方法的建立提供了借鉴。

简介：摘要目的建立指环病毒7型(TTV7)、8型(TTV8)、10型(TTV10)实时荧光定量PCR检测体系并进行临床验证。方法本研究根据GenBank已发布的TTV7、TTV8、TTV10基因序列设计特异性引物，构建重组质粒pMD19-T-TTV7、pMD19-T-TTV8、pMD19-T-TTV10，以其作为阳性标准品建立了基于FAM-Eclipse探针法的实时荧光定量PCR检测，并进行特异性、敏感性试验与临床样本检测。结果TTV7、TTV8、TTV10的实时荧光定量PCR检测体系标准曲线方程分别为y＝-0.340 2x+114.780 0、y＝-0.351 1x+114.940 0、y＝-0.348 9x+115.020 0，相关系数都在0.99以上，与其他病毒无交叉反应，检测敏感性分别为108拷贝/μl、84拷贝/μl、98拷贝/μl。在临床小儿血清样本中的检测阳性率分别为10.9%、2.1%和4.3%。结论本研究建立的TTV7、TTV8、TTV10实时荧光定量PCR检测体系具有特异性强、灵敏性高等特点，可为临床血清样本TTV检测提供一个快速手段。