简介:用原子力显微镜(AFM)观察线性DNA并探讨其成像条件。用RT-PCR技术扩增柯萨奇B1病毒VP1基因DNA片段,纯化回收后配制成含和不含1mmol/LMgCl2的水溶液,DNA终浓度为100μg/ml。分别取20μl滴加在新鲜解理的云母片上,吸收1min,用滤纸吸去残液,氮气吹干,在室温下采用MultiModeAFMNanoscopeⅢa的敲击模式成像。同时比较新制备和多次使用过的探析所获得图像的质量,对两种探针进行扫描电镜观察。电泳证明获得了0.83kb的VP1基因DNA线性片段,Mg^2+存在时,DNA在云母片上吸附延展较好,所获图像质量优于无Mg^2+时。新制备的探针较多次使用过的探针所获图像分辨率更高。DNA分子的表现宽度为18±2.9nm,高度为0.8±0.2nm。说明AFM能以高分辨率直接观察DNA分子,Mg^2+的存在和高质量的探针有助于获得理想的图象。
简介:目的:制备抗黄曲霉尿酸氧化酶单克隆抗体。方法:采用杂交瘤技术,获得2株针对重组黄曲霉尿酸氧化酶(rUOX)的杂交瘤细胞McAb17和McAb3;采用盐析和A蛋白亲合层析柱纯化该抗体。结果:McAb17和McAb3的腹水效价达到1:512000,纯化后获得纯度大于95%的单抗,抗体亚类(型)分别为IgG1/k型和IgG2a/k型;ELISA结果显示制备的单抗与rUOX和Rasburicase(商品化rUOX)可发生特异反应。结论:制备了抗黄曲霉尿酸氧化酶单克隆抗体McAb17和McAb3,为检测rUOX在动物体内的代谢变化提供了良好的实验基础。
简介:克隆河南人免疫缺陷病毒(HIV)感染者HIV-1B型株tat基因完整编码框序列,并分析比较其编码产物的序列结构特点.使用重叠PCR技术,从河南省1名HIV-1感染者外周血标本中扩增出tat基因第一和第二外显子并重组为完整的tat基因序列.获得的HIV-1B病毒株tat基因,第一外显子为263bp,第二外显子为214bp.将该基因编码产物与其他HIV-1株Tat蛋白经DNA软件编辑并翻译成蛋白质,使用ClustalX1.81进行多序列对比分析发现,第一外显子编码产物的3个保守区域的氨基酸组成大致相同,只有少数氨基酸存在差异.由于Tat蛋白不同病毒株间有高度保守的Cys富集区、核心区和碱性氨基酸富集区,tat基因的克隆为研究其功能并以其为靶点设计和筛选抗艾滋病的药物奠定了基础.
简介:目的:构建带Myc标签的LC3B—PLA2基因的真核表达质粒,获得LC3B—PLA2融合蛋白,并应用LC3B—PLA2研究Atg4B对LC3B的切割作用。方法:以本实验室保存的乳腺文库为模板,PCR扩增获得LCgB序列,与PLA2G]O拼接后插入pCMV—Myc载体,用构建的重组质粒转染HEK293T细胞,Western印迹检测融合蛋白的表达,用LC3B—PLA2与Atg4B共转染的方法检测Atg4B对LC3B的切割作用。结果:菌液PCR、重组质粒双酶切及测序均表明重组质粒构建成功,Western印迹结果表明融合蛋白在HEK293T细胞中获得表达,LC3B—PLA2真核表达蛋白能够应用于Atg4B对LC3B切割作用的研究。结论:构建了pCMV—Myc—LC3B—PLA2真核表达质粒,LC3B—PLA2融合蛋白在Atg4B对LC3B切割作用的研究中至关重要,为进一步研究Atg4B在自噬过程中的作用奠定了基础。
简介:目的:从中国南海芋螺中克隆新的J超家族芋螺毒素,并进行序列和进化分析。方法:以芋螺毒腺管总RNA为模板,采用3′-RACE及巢式PCR的方法扩增J超家族芋螺毒素基因,并将得到的目的基因与pMD18-T载体连接并转化大肠杆菌DH5α,经测序比对后,获得新的J超家族毒素,利用软件BioEdit、ClustalX及Mega5.05进行进化分析。结果:获得12个新的J超家族芋螺毒素前体肽序列,其氨基酸组成具有新颖性,在进化树上与已报道的J超家族毒素处于不同的进化分支。结论:12个新的J超家族毒素与已报道的毒素序列之间的同源性较低,是J超家族新成员。
简介:目的:对毕赤嗜甲醇酵母工程菌inu-26高密度培养表达黑曲霉菊粉内切酶的条件进行优化,找出最佳的外源蛋白表达条件。方法:在摇瓶优化培养的基础上进行发酵罐高密度培养,优化最佳产酶条件。结果:以葡萄糖为碳源、微量元素添加量100~200mL/L、甲醇浓度1g/L、pH6.0~7.0、诱导时间96h时酶的表达量最高;摇瓶模拟高密度培养表明影响酵母生长的最主要因素葡萄糖和硫酸铵的最佳浓度分别为20~45和11.5g/L;利用培养基F1进行高密度培养优于其他培养基,工程菌生长符合指数生长曲线,细胞生长延迟期为1.36h,比生长速率μ为0.4846h-1。结论:以葡萄糖为碳源,采用葡萄糖-甲醇混合诱导和100%甲醇单一诱导相结合,在菌体鲜重约为280g/L时连续诱导96h,菌体生长良好,不会出现自溶,且酶的表达量最高,为摇瓶培养的3倍多,酶活最高可达540U/mL。
简介:目的:利用基因定点突变的方法将葡萄球菌肠毒素C2(SEC2)的31位定点突变,以获得抑瘤效果增强的肠毒素。方法:利用基因定点突变的方法,将SEC2中31位的His用Asn替代,转入大肠杆菌中诱导表达,采用CM弱阳离子层析柱纯化蛋白,并用SDS-PAGE和Western印迹对其进行鉴定,通过MTS法检测其体外抗肿瘤活性。结果:构建了突变体蛋白SEC2(H31N),并在大肠杆菌中实现了高效表达。体外实验表明,在相同浓度下,SEC2(H31N)对多种肿瘤细胞的抑制作用明显优于野生型SEC2,尤其在低浓度下此现象更为明显。对于5个受试细胞株,SEC2(H31N)的IC50均低于SEC2;SEC2(H31N)浓度分别为0.01~10、0.01和0.1ng/mL时,对肿瘤细胞SMMC-7721、HepG2、A549的生长抑制率与SEC2相比均显著提高。结论:同野生型SEC2相比,突变体蛋白SEC2(H31N)对肿瘤生长的抑制作用得到了提高。
简介:2009年3月在美国和墨西哥流感样患者的呼吸道标本中鉴定出新的猪源性甲型H1N1流感病毒。该病毒可人-人传播,已蔓延到112个国家和地区。为了遏制不断重组或重配的流感病毒,各国学者对甲型H1N1流感病毒的分子生物学特征、复制周期及实验室诊断做了细致的研究,以研发相应的药物或疫苗,这些成就为世界各国防控今年新鉴定的猪源性甲型H1N1流感病毒感染发挥了重要作用。现就猪源性甲型H1N1流感病毒的鉴定、基因组结构特征做一综述。