简介:将壳聚糖纳米粒包裹的报告基因pEGFP-N1质粒转染至HEK293细胞,并在HEK293细胞中成功表达荧光蛋白的基础上,进一步将本室自行构建的PNP基因的真核高效表达载体质粒pcDNA3-PNP转染至HEK293细胞.转染72h后,对转染的HEK293细胞给予前体药6-MPDR至终浓度40μg/ml,一天后,采用MTT比色法测定药物对细胞增值的影响,并进行统计学处理.实验结果表明采用壳聚糖纳米粒转染试剂转染并给予前体药6-MPDR的实验组活细胞数,与用壳聚糖转染但不给前体药6-MPDR的对照组活细胞数相比,有显著差异(P<0.05),说明新筛选出的壳聚糖纳米粒转染试剂可以将PNP自杀基因递送至靶细胞中,并在细胞中进行表达,从而使PNP/6-MPDR自杀基因系统发挥杀伤细胞的作用.分别采用相同工作浓度的脂质体与壳聚糖纳米粒转染试剂转染相同浓度的基因质粒,壳聚糖纳米粒对靶细胞生长数量影响很小,说明的壳聚糖纳米粒细胞毒性大大低于阳离子脂质体的细胞毒性.
简介:目的:构建EF-1α-Flag到pcDNA3.0表达载体上,在哺乳动物细胞中表达并纯化延伸因子1α(EF-1α),测定其对体外蛋白翻译的影响。方法:通过PCR技术从293T细胞cDNA文库中扩增EF-1α基因片段,连接到pcDNA3.0载体上,经电泳、测序和转入细胞中检测EF-1α-Flag蛋白表达等方式验证所构建的重组质粒是否正确,然后经Flag肽置换法纯化出EF-1α蛋白用于体外蛋白翻译实验,萤光素酶活性检测翻译出的蛋白含量。结果:测序和蛋白表达鉴定结果表明扩增的EF-1α-Flag基因序列正确,所构建的重组载体在哺乳动物细胞中能获得表达;考马斯亮蓝染色发现经Flag肽置换的EF-1α蛋白纯度较高,在体外蛋白翻译实验中EF-1α蛋白能促进蛋白的翻译。结论:从哺乳动物细胞中纯化的EF-1α蛋白能促进蛋白翻译,可能与其作为翻译延伸因子相关,为进一步研究EF-1α的功能奠定了基础。
简介:目的:构建40S核糖体蛋白S6的原核表达载体,表达并纯化S6蛋白,将其作为底物用于S6激酶(S6K)的体外活性测定。方法:采用RT-PCR方法从人胚肾细胞HEK293中获取S6cDNA,将扩增产物克隆至大肠杆菌表达载体中,进行酶切及测序鉴定;IPTG诱导GST-S6融合蛋白在大肠杆菌中表达,用谷胱甘肽亲和层析纯化GST-S6,免疫沉淀法检测该蛋白是否可作为底物用于S6K的体外激酶活性测定。结果:酶切及测序鉴定表明构建了S6原核表达载体,并表达及纯化出GST-S6融合蛋白,相对分子质量为55×103。该蛋白可用于S6K的体外激酶活性测定,特异性强。结论:S6蛋白的克隆、表达与纯化成功,可用于S6K的体外激酶活性测定,为研究S6K的功能奠定了基础。
简介:目的:观察Runt相关转录因子2(Runx2)基因过表达对骨髓间充质干细胞(MSCs)体外迁移能力的影响。方法:分离培养兔MSCs,用已构建的携带Runx2基因的腺病毒载体Ad-Runx2、单纯腺病毒及AMD3100处理MSCs;应用Transwell小室检测MSCs体外迁移能力的变化,QPCR检测基质细胞衍生因子(SDF-1)和趋化因子受体(CXCR4)mRNA的表达,ELISA检测各组细胞培养液上清中SDF-1的含量,Western印迹检测CXCR4蛋白表达水平。结果:Ad-Runx2转染MSCs组细胞迁移数明显增多(P〈0.01),AMD3100处理MSCs后细胞迁移数明显降低(P〈0.01);QPCR、ELISA、Western印迹结果显示Ad-Runx2转染能促进MSCs中SDF-1及CXCR4的表达(P〈0.01)。结论:Runx2基因过表达能促进MSCs的体外迁移,这与其激活SDF-1/CXCR4信号轴相关。
简介:目的:利用基因定点突变的方法将葡萄球菌肠毒素C2(SEC2)的31位定点突变,以获得抑瘤效果增强的肠毒素。方法:利用基因定点突变的方法,将SEC2中31位的His用Asn替代,转入大肠杆菌中诱导表达,采用CM弱阳离子层析柱纯化蛋白,并用SDS-PAGE和Western印迹对其进行鉴定,通过MTS法检测其体外抗肿瘤活性。结果:构建了突变体蛋白SEC2(H31N),并在大肠杆菌中实现了高效表达。体外实验表明,在相同浓度下,SEC2(H31N)对多种肿瘤细胞的抑制作用明显优于野生型SEC2,尤其在低浓度下此现象更为明显。对于5个受试细胞株,SEC2(H31N)的IC50均低于SEC2;SEC2(H31N)浓度分别为0.01~10、0.01和0.1ng/mL时,对肿瘤细胞SMMC-7721、HepG2、A549的生长抑制率与SEC2相比均显著提高。结论:同野生型SEC2相比,突变体蛋白SEC2(H31N)对肿瘤生长的抑制作用得到了提高。
简介:目的:与定量比值法比较,探讨全自动直接定量法检测红细胞葡糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PD)活性的可行性。方法:同时采用定量比值法(即硝基四氮唑蓝定量法)和全自动直接定量法,检测219例肝素抗凝静脉血标本的红细胞G-6-PD活性。结果:定量比值法检测G-6-PD缺乏的阳性率为9.13%,全自动直接定量法检测的G-6-PD缺乏阳性率为9.58%,两种方法检测结果无显著性差异(P〉0.05)。结论:定量比值法简单易行,适用于卫生条件有限的基层医疗单位;全自动直接定量法快速准确,是一种可批量检测的理想筛选方法。
简介:目的:参照美国国家实验室标准委员会(NCCLS)的EP9-A2文件,对测定血清中甲胎蛋白(AFP)含量的电化学发光免疫法和光激化学发光法进行方法学比对试验,比较二者结果的-致性。方法:收集40例患者血清标本,以罗氏Cobas601电化学发光免疫分析仪为比较仪器(Ⅳ),博阳LICA光激化学发光免疫分析仪为实验仪器(Y),同时检测血清中AFP的含量;分析2种生化仪测定结果之间的相关性和2种方法检测结果的-致性。结果:2种仪器测定的结果相关性良好(r=O.9925),预期偏倚可以接受。结论:在严格按操作规程进行检测的前提下,2种方法测定结果基本-致,其偏差可为临床所接受。当同-实验室同-检验项目存在2种以上检测方法时,应进行方法比对,判断其临床可接受性,以保证检验结果的可比性。
简介:目的:构建GFE-1多吠与重组人肿瘤坏死因子d(rmhTNF一仅)融合蛋白(GFE-1-rmhTNF),研究该融合蛋白的体外活性和体内分布。方法:利用基因工程方法,将人工合成的编码GFE—l的寡核苷酸片段连接在rmhTNF—d序列的3’端,转入大肠杆菌中诱导表达,采用Q—SepharoseFF阴离子层析柱和SP—SepharoseFF阳离子层析柱纯化蛋白,SDS—PAGE和Western印迹鉴定,测定该融合蛋白的体外活性,观察其在小鼠体内的分布情况。结果:构建了融合蛋白GFE-1-rmhTNF,并在大肠杆菌中获得高效表达。体外活性实验显示,GFE-1-rⅢhTNF对L929细胞有明显的杀伤活性;体内分布实验证实,GFE-I-rmhTNF在小鼠肺组织的富集远高于肝肾组织。结论:构建了融合蛋白GFE-1-rmhTNF.,可显著杀伤L929细胞并特异性富集于小鼠肺组织。
简介:目的:探讨化学发光法在梅毒实验诊断中的应用价值。方法:采用化学发光法、RPR法、TPPA法分别检测150例梅毒患者及125例非梅毒患者血清。结果:化学发光法、RPR法、TPPA法对150例梅毒血清标本和125例非梅毒血清标本对照组的敏感性分别为98.0%、75-3%和97.3%,特异性分别为98-3%、81.6%和97.5%。化学发光法、TPPA法敏感性和特异性明显高于RPR法,差异有统计学意义(P〈0.05);化学发光法和TPPA法相比,敏感性和特异性差别不大,差异没有统计学意义(P〉0.05);联合3种方法检测,梅毒诊断阳性率可提高到100%。结论:梅毒的化学发光检测法具有极高的敏感性和特异性,是一种自动化、定量检测方法,能够用于梅毒的准确诊断和疗效观察,与传统方法联检可防止误诊、漏诊,具有较大的临床应用价值。