简介:摘要目的检测espO基因敲除对肠出血性大肠埃希菌(EHEC)生物学特性的影响。方法自杀质粒pCVD442-ΔespO介导的两步法构建espO基因敲除菌株(ΔespO),pTrc99a质粒构建espO基因回补突变株(CΔespO),不同EHEC菌株感染HeLa细胞以了解espO基因在感染过程中的生物学功能与致死作用。结果PCR和电泳以及基因测序结果表明,ΔespO和CΔespO突变株构建成功。与野生株相比,ΔespO和CΔespO突变株的生长速度无明显差异,表明espO基因不影响细菌的生长与繁殖。此外,EspO可激活肿瘤坏死因子(TNF)诱导的NF-κB信号通路,而效应蛋白NleB能够抑制该激活过程。在细菌感染细胞试验中,EspO不能抑制TNF和TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand)诱导的细胞死亡。结论本研究成功构建了EHEC espO基因敲除和回补突变株菌株,初步探究了espO与宿主细胞的相互作用及该基因在感染过程中对细胞凋亡的影响,为后续深入研究细菌EspO蛋白的体外生物学活性以及体内感染过程中的致病作用提供实验依据。
简介:摘要目的鉴定SseK3蛋白宿主中新的生物学底物以及对其功能的影响。方法通过酵母双杂交系统(yeast-two-hybrid,Y2H)从HeLa cDNA文库中筛选SseK3潜在结合蛋白;通过细胞共表达和体外活性试验检测SseK3对底物蛋白的精氨酸N-乙酰葡萄糖胺化(Arg-GlcNAc)修饰;通过点突变检测SseK3对底物蛋白的修饰位点;通过免疫共沉淀试验检测底物蛋白的Arg-GlcNAc修饰对其互作蛋白结合能力的影响。结果酵母双杂交和基因测序结果表明,SseK3的一个全新底物是Snapin;SseK3在细胞内和体外均可以Arg-GlcNAc修饰Snapin;修饰位点位于Snapin蛋白C端的119和120位精氨酸;Arg-GlcNAc修饰Snapin抑制了Snapin-SNAP25的结合。结论本研究成功筛选到SseK3的一个新的宿主底物蛋白Snapin,初步研究了SseK3对Snapin的Arg-GlcNAc修饰及该修饰对Snapin功能的影响,为后续进一步理解细菌的Arg-GlcNAc修饰功能以及在病原微生物感染过程中的作用机制提供理论依据。