PLGA铁氧体磁性微球制备工艺的正交设计研究

1刘兴2王绥和

海口市制药厂有限公司 海南省海口市 570100

【摘要】目的：对PLGA铁氧体磁性微球制备工艺的筛选、优化。方法：通过溶剂挥发法制备PLGA铁氧体磁性微球。正交设计优化PLGA铁氧体磁性微球制备的处方工艺。以微球的平均粒径大小、载药量和包封率3个指标作为微球质量的评价标准。判断最佳处方工艺。结果：以PLGA浓度为6.0mg/ml，明胶的浓度为 0.5%，油水相比值为1：4，作为最佳处方工艺，此时PLGA铁氧体磁性微球综合质量最佳。结论：3个因素中，PLGA浓度对微球质量影响最大，油相水相比值以及水相中明胶的浓度对其影响次之。

【关键词】正交设计；PLGA[4]；铁氧体；磁性微球

前言

微球(microsphere)是指药物溶解或分散在高分子材料基质中形成的粒径为1～40μm的微小球状实体,而粒径在10～1000 nm之间的通常称之为纳米球(又称毫微球、纳米粒)[5]。目前有关微球应用的报道很多,很多微球产品已经进入市场,包括米诺环素可吸收性微球、美国Genetech公司的生长素、日本武田公司的亮丙瑞林微球、Gavini等[3]用乳化-喷雾干燥法制备了用于治疗眼部严重感染的多肽类抗生素万古霉素PLGA微球等[6]。

本研究的目的是制备磁性微球。磁性微球(magnetic microspheres)在外加磁场的作用下,磁性微球可以将药物载至预定的区域,提高靶区药物浓度,从而达到靶向给药的目的。Karmer等用人血清蛋白将柔红霉素盐酸盐与基嘌呤包成磁性微球,试用于胃肠肿瘤,取得了良好的治疗效果[8]。微球的包封率和释放是评价微球制剂的两个最重要的指标,其好坏直接决定了微球制剂的成败。

本研究以PLGA即乳酸羟基乙酸共聚物（polylactic-glycolic acid）为高分子原料，采用溶剂挥发法制备磁性微球。通过正交设计来对PLGA铁氧体磁性微球的制备工艺进行优化和筛选。本研究选取3个因素包括：油相/水相比值、混合相中明胶的浓度以及PLGA的浓度；每个因素设3个水平，选用L9（34）正交设计[1]表对磁性微球处方进行优化。为对微球的质量进行准确评价，拟选用头孢哌酮做为载体药物，并以其载药量和包封率做为微球的评价标准。这将为制备高效、速效、低毒的新型制剂提供理论依据。

1.仪器与试药

1.1仪器与试药

 JJ-1精密增力电动搅拌器（江苏神科仪器有限公司）、AA-670型原子吸收分光光度计（日本岛津）、Y50医用磁铁（表面磁场5000G，上海杰灵磁性器材有限公司）、CK2倒置相差显微镜（Olympus）、低温高速离心机（美国Beckman）、PSS380型激光散射粒度分析仪、UV-2201型紫外分光光度计（日本岛津）；BP211D型电子天平（瑞士梅特勒）。

镁铁铁氧体（MgFe2O4，10nm,北京化工大学无机教研室惠赠）、PLGA(50/50，分子量20000，上海医药工业研究所)、明胶（Sigma公司）、Tween80（广州南方化玻公司，进口分装）、头孢哌酮钠原料药（哈药集团制药总厂，批号 B200706313）、水为蒸馏水、其他试剂均为分析纯。

2.方法

2.1PLGA铁氧体磁性微球的制备

2.1.1磁性微球的制备

采用溶剂挥发法制备磁性微球。精密称取一定量的PLGA和头孢哌酮溶于二氯甲烷液中，待其全部溶解澄清后作为溶剂相。将此溶剂相滴入含有Tween80、明胶及MgFe2O4的水相，在60℃水浴中，通过电动搅拌（1500r/min）除去二氯甲烷。混悬液置于磁铁之上出去未包封的磁铁，低温高速离心（15000rpm/min），沉淀即为磁性微球，并用蒸馏水反复洗涤沉淀，冷冻干燥，即得。

2.1.2正交设计优化磁性微球的制备工艺

根据单因素试验，影响的磁性微球粒径大小、包封率和载药量的主要因素有PLGA的浓度（A）、明胶浓度（B）、溶剂相/非溶剂相体积比（C）等，在一定范围内对以上3个因素各取3个水平进行筛选（见表1），按正交设计表L9(34)(表2)进行试验。

表1 正交设计因素、水平表

水      平	因    素
	A PLGA浓度（mg/ml）	B 明胶浓度%（v/v）	C 有机相：水相
1	2.0	0.25	1:4
2	4.0	0.5	1:3
3	6.0	0.75	1:2

2.1.3优化指标的选取和测定

参照文献[2]介绍的统计方法，以粒径1～40μm之间的粒子分布百分数、MNP的载药量（DL）、药物包封率（DTE）,3个指标作为优化技术的评估指标，通过如下公式确定单个指标的优化指数和总优化指数（DF）,对MNP制备工艺进行综合考察。

代表3个指标的实际测量值，和代表可接受的最大和最小值，其选取以实验结果或经验为基础，代表单个指标的优化指数，当。当。由每一个值确定，后者由每个和认定的与求出。MNP（1～40μm)分布百分数的与为80%和10%

。MNP的载药量（DL）的与为95%和10%。药物包封率(DTE)的与为100%和20%。

表2正交设计L9(34)实验表

No.	因          素			DF
	A	B	C
1	1	1	1		0.1375
2	1	2	2		0.1563
3	1	3	3		0.2512
4	2	1	2		0.4654
5	2	2	3		0.3123
6	2	3	1		0.3292
7	3	1	3		0.8725
8	3	2	1		0.8311
9	3	3	2		0.8929
K1	0.5450	1.4753	1.2977
K2	1.1069	1.2996	1.5145
K3	2.5964	1.4733	1.4360
R	2.0514	0.1757	0.2168

2.2包封率（DTE）和载药量（DL）的测定

采用紫外分光光度法测定头孢哌酮含量，在200～400nm波长范围内扫描，绘制吸收图谱（图1）。结果表明，头孢哌酮钠在206nm、230nm、260nm处均有吸收峰，因260nm为头孢菌素类的特征吸收峰，故选260nm为测定波长。精密称取头孢哌酮钠10mg于10ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，制成1mg/ml的储备液。取上述头孢哌酮储备液适量，加水稀释成系列浓度4.0、8.0、16.0、24.0、32.0μg/ml的溶液，以水为空白，在260nm处测定头孢哌酮吸收度。

取磁性微球混悬液适量，于4℃，15000rpm/min下离心30min,沉淀用蒸馏水水洗3次，合并上清，混匀，分别测定混悬液中头孢哌酮的含量（W1）和合并液中游离的头孢哌酮含量（W2）,磁性微球中头孢哌酮的含量W=W1-W2,按下式计算包封率（DTE）和载药量（DL）:

DTE=(W1-W2)/W1×100%                  

DL=W/(W+WPLGA)×100%                  

式中WPLGA为加入的PLGA的量。

2.3分散性和磁响应性考查

3.结果

3.1正交试验

根据正交设计的结果（表2）分析[7]，3个因素对磁性微球影响的大小依次为A>C>B,PLGA的浓度对磁性微球的质量影响最大，油水相的比例次之，明胶的浓度对其影响相对较小。再结合实验结果及成本因素综合考虑，最佳实验处理为：A3B2C1，其载药量和包封率分别为87％和95％。

3.2优化工艺的确定

精密称取60mgPLGA溶于10ml二氯甲烷液中，待其全部溶解澄清后作为溶剂相。将此溶剂相滴入含有1%Tween80、0.5%明胶及0.01%MgFe2O4的水相，在60℃水浴中，电动搅拌作用下将此有机相注入（60滴/s）水相中，30min后待二氯甲烷全部挥发，所得混悬液置于磁铁上静置30min，除去未包裹MgFe2O4和较大粒子，上清即载药磁性微球的溶液，将此溶液4℃，15000rpm/min离心30min，弃去上清液，沉淀用蒸馏水洗3次，除去未包裹的游离药物，冷冻干燥，即得（图2）。

3.3分散性和磁响应性

取冻干磁性微球粉末能较快分散于生理盐水液且无聚集，将该溶液置于磁铁之上，待溶液澄清时所需时间为190s,说明该溶液的磁响应性强。

取冻干磁性微球粉末适量，置于玛瑙研钵内，使均匀分散，用普通的磁力搅拌子在其表面扫过，即有粉末吸附其上且出现定向排列，表现出磁性（图3）。

图2 制得的铁氧体磁性微球                  图3微球磁性测试

3.4头孢哌酮线性关系考察

在260nm处测定头孢哌酮钠吸收度,吸收度（A）对浓度（C）的回归方程为：A头=0.027C-7.71×10-3(Ⅰ),r=0.996,回收率试验结果：平均回收率为101.10%，相对标准偏差（RSD）为0.97%（n=5）。

图1头孢哌酮紫外吸收光谱

4.结论

当试验温度控制在60摄氏度、搅拌速度在1500r/min、加入1%Tween80条件下，随着PLGA浓度(也称黏度)下降,微球粒径变小,包裹率降低,原因是当PLGA浓度降低时,微球沉淀速度减慢,从而减慢了药物包裹,增加了药物降解、外流等损失的可能性。而对载药量的影响则使PLGA浓度降低,在微球中的相对比例减小,载药量相对增加。综上所述，在保证载药量和包封率的前提下，当控制油相/水相比值，PLGA浓度以及混合相中明胶的浓度这三个因素时，使PLGA的浓度适量小、明胶的浓度小、油相/水相比值小时，PLGA铁氧体磁性微球成型效果最好。

【参考文献】

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injecttion:formulation and characterization.J-Microencapsul,1999,16(5):

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[3] Gavini E, Chetoni P, Cossu M,et al. PLGA microspheres for theocular delivery of a peptide drug, vancomycin using emulsification/spray-drying as the preparation method:in vitro/in vivostudies[J].EurJPharm Biopharm,2004,57(2):207-212.

[4] 苏焱, 王继麟, 薛红刚, 等. 聚乳酸/ 聚乙醇酸可生物降解微球的制备及其对RNP 的佐剂作用[J ]. 中国生物制品学杂志, 2000, 13(4) : 224

[5] Feng L, Qi XR, Zhou XJ,et al.Pharmaceutical and immunologicalevaluation of a single-dose hepatitis B vaccine using PLGA micro-spheres[J].J Control Release,2006,112(1):35-42.

[6] 钱军民.张兴.吕飞.等.聚合物徽球的制备及在药物缓释/探释中的应用[J].精细石油化工进展.2..2.3:22-27. 

[7] 杜丽娜，郭庆东，刘燕，梅兴国.牛血清白蛋白—PLGA微球制备的单因素考察 [A] (2005)05-0049-02             

[8] 马秀玲,黄丽梅,郑思宁,等.磁性微球的制备及研究进展[J].广州化学,2003,28(3):58-64·