黏液型铜绿假单胞菌耐药特征及碳青霉烯酶流行特征研究

张展霞　　丁延龄　　黄丽君

罗定市人民医院　　广东罗定　 527200

摘要：目的 研究黏液型铜绿假单胞菌（PA）耐药特征及碳青霉烯酶流行特征。方法 收集罗定市人民医院就诊患者经临床分离、鉴定为黏液型PA的100份菌株，分析菌株药敏性和耐药表型，构建碳青霉烯类耐药菌株库，开展产酶筛查，分析云浮地区黏液型PA耐药特征及耐碳青霉烯类酶的流行特征。结果 100株黏液型PA标本主要来自痰液标本（占78.0%）；对亚胺培南、美罗培南的耐药率分别为17.0%和15.0%；其中耐药菌株有63株（63.0%），多药耐药菌株19株（19.0%），广泛耐药菌株2株（2.0%）；碳青霉烯类耐药菌株有25株，主要来自ICU（48.0%）；20株对碳青霉烯类耐药的菌株中有8株产碳青霉烯酶（占40%），其中产金属酶5株（占25.0%），产丝氨酸酶2株（占10.0%），同时产金属酶和丝氨酸酶的菌株1株（占5.0%）；耐碳青霉烯酶菌株数有随年代增长趋势。结论 云浮地区黏液型PA有较高的耐药率，并且相当部分为多药耐药菌株和碳青霉烯类耐药菌株，通过检测PA产金属酶可间接反映碳青霉烯类耐药水平。

关键词：黏液型铜绿假单胞菌；耐药特征；碳青霉烯酶流行特征

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,PA）为革兰氏阴性杆菌，是一种可引起医院感染的主要条件致病菌。根据菌落形态，可将PA分为黏液型和非黏液型，在一定条件下非黏液型PA可转化为黏液型PA，例如受到慢性炎症刺激或侵入性操作的诱导，PA会产生大量藻酸盐多糖化合物、纤维蛋白等物质，使PA细胞壁上包裹浓厚致密的生物被膜，它的存在直接影响到抗菌药物的渗入，在连续低剂量抗菌药物刺激下更易诱导PA产生耐药性[1]。碳青霉烯类抗生素是临床上对抗PA的常用药物，但随着此类抗生素的广泛应用，PA产生的碳青霉烯酶可使PA对碳青霉烯类耐药[2]。本课题组收集我院就诊患者临床分离株开展黏液型PA耐药特征及碳青霉烯酶流行特征研究，为临床合理用药提供理论依据。

1资料与方法

1.1菌株来源

选取我院已有检测项目为“细菌培养”的住院或门诊患者，采用的样本为正常诊疗时采集标本培养检测后的剩余菌株，经分离、鉴定为黏液型PA，共100份。

1.2菌株培养与鉴定

将收集的菌株进行复测。严格按照《全国临床检验操作规程》对收集的菌株进行培养、分离和鉴定。观察菌落形态多样、无色，可以见到黏稠状、露滴状及胶冻状菌落，且菌落边缘不规则。用接种环挑起无金属光泽、无特殊气味的菌落，分纯后所有菌株经法国梅里埃VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定及药敏分析仪进行菌株鉴定和复测。铜绿假单胞菌质控菌株为ATCC 27853。

1.3菌株耐药表型分析

采用纸片扩散法（K-B法），对12种临床代表抗生素（亚胺培南、美罗培南、阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、头孢吡肟、头孢他啶、左氧沙星、环丙沙星、哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦、氨曲南）检测菌株对抗菌药物的敏感性，结果以敏感、中介、耐药表达，并结合耐药表型确定菌株属于多药耐药、广泛耐药还是全耐药菌株。分离菌株鉴定结果为耐药或中介，即判断该菌株对抗生素不敏感，该菌株至少对一种抗生素不敏感，即认为该菌株对此类抗生素耐药。分离菌株对三类或三类以上结构不同抗生素同时耐药，即判断该菌株为多药耐药菌株；分离菌株仅对黏菌素和替加环素敏感，而对常规抗菌药物几乎全部耐药，即判断该菌株为广泛耐药菌株；分离菌株对目前所有体外药敏试验药物全部耐药，即判断该菌株为全耐药菌株。

1.4耐药菌库构建

基于耐药表型分析结果，筛选出药敏结果显示对碳青霉烯类抗生素亚胺培南或美罗培南中任意一种耐药的菌株，构建碳青霉烯类耐药菌株库。

1.5产酶筛查

选择20份对碳青霉烯类耐药菌株，用Carba NP法、mCIM和eCIM法相结合，对碳青霉烯类耐药菌株进行产酶筛查，得到是否产碳青霉烯酶以及产酶组别的判定结果。Carba NP法采用CLSI M-25S（2015年）规定的检验流程进行试验，阳性结果判断为产碳青霉烯酶，阴性结果判断为未检出碳青霉烯酶。阴性质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922，阳性质控菌株为肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705。mCIM法和eCIM法联合试验用于分辨产酶组别（A类碳青霉烯酶-丝氨酸β内酰胺酶和B类碳青霉烯酶-金属β内酰胺酶），试验方法参照CLSI M02-Ed13（2018年）。丝氨酸酶阳性质控菌株为肺炎克雷伯菌ATCC BAA 1705，金属酶阳性质控菌株为肺炎克雷伯菌ATCC BAA 2146，碳青霉烯酶阴性质控菌株为肺炎克雷伯菌ATCC BAA 1706。

1.6汇总分析

描述云浮地区黏液型PA耐药特征，明确黏液型PA中耐碳青霉烯类酶的流行现状，预测流行趋势。

1.7统计学分析

采用WHONET 5.6软件进行药敏统计，采用SPSS 24.0软件分析耐药特征及耐碳青霉烯类酶的流行特征。

2结果

2.1菌株来源

100株黏液型PA标本中，痰液标本最多，占比78.0%，其次为肺泡灌洗液、伤口和创面分泌物，分别占比15.0%和4.0%。见表1。

表1 100株黏液型PA菌株标本来源〔n(%)〕

标本类型	痰液	肺泡灌洗液	伤口和创面分泌物	尿液、血液等	合计
菌株数	78(78.0)	15(15.0)	4(4.0)	3(3.0)	100(100.0)

2.2药敏结果

100株黏液型PA标本药敏结果显示，黏液型PA对环丙沙星耐药率最高，达30.0%；对阿米卡星耐药率最低，仅为5.0%；对亚胺培南、美罗培南的耐药率分别为17.0%和15.0%。见表2。

表2 100株黏液型铜绿假单胞菌对12种

临床代表抗生素耐药情况〔n(%)〕

抗生素	敏感(S)	中介(I)	耐药(R)
亚胺培南	80(80.0)	3(3.0)	17(17.0)
美罗培南	82(82.0)	3(3.0)	15(10.0)
阿米卡星	92(92.0)	3(3.0)	5(5.0)
庆大霉素	77(77.0)	5(5.0)	18(18.0)
妥布霉素	85(85.0)	2(2.0)	13(13.0)
头孢吡肟	79(79.0)	6(6.0)	15(15.0)
头孢他啶	75(75.0)	7(7.0)	18(18.0)
左氧氟沙星	82(82.0)	4(4.0)	14(14.0)
环丙沙星	65(65.0)	5(5.0)	30(30.0)
哌拉西林/他唑巴坦	83(83.0)	4(4.0)	13(13.0)
头孢哌酮/舒巴坦	70(70.0)	11(11.0)	19(19.0)
氨曲南	62(62.0)	13(13.0)	25(25.0)

2.3耐药表型

100株黏液型PA标本中，敏感菌株37株，占比37.0%；对1～2类抗生素耐药的菌株有42株，占比42.0%；多药耐药菌株有19株，占比19.0%；广泛耐药菌株有2株，占比2.0%；无全耐药菌株。

2.4碳青霉烯类耐药菌株库构建

对亚胺培南或美罗培南任意一种抗生素耐药的菌株有25株，其中ICU（包括呼吸科重症监护室、心外科重症监护室、急诊重症监护室、新生儿科重症监护室等）12株，占48.0%；呼吸科、康复科、新生儿科各3株，分别占12.0%；其他科室有4株，占16.0%。

2.5产酶筛查

20株对碳青霉烯类抗生素耐药的菌株中有8株产碳青霉烯酶，占比40.0%；其中产金属β内酰胺酶5株，占比25.0%；产丝氨酸β内酰胺酶2株，占比10.0%；同时产金属β内酰胺酶和丝氨酸β内酰胺酶的菌株有1株，占比5.0%；不产碳青霉烯酶的菌株有12株，占比60.0%。

2.6碳青霉烯酶流行特征

100株黏液型PA标本中，耐药菌株数、多药耐药菌株数、广泛耐药菌株数耐碳青霉烯酶菌株数随年分布情况见表4。可见，耐药菌株数、耐碳青霉烯酶菌株数有随年代增长趋势。

表3 100株黏液型PA菌株中耐碳青霉烯酶菌株年分布情况〔n(%)〕

年份	2021年	2022年	2023年	合计
总株数	21	37	42	100
耐药菌株数	9(42.9)	15(40.54)	17(40.5)	63(63.0)
多药耐药菌株数	4(19.0)	7(18.9)	8(19.0)	19(19.0)
广泛耐药菌株数	0(0.0)	1(2.7)	1(2.4)	2(2.0)
耐碳青霉烯酶菌株数	5(23.8)	9(24.3)	11(26.2)	25(25.0)

3讨论

PA被称作条件致病菌，因其在自然界中广泛分布，在医院环境中也极为常见，很容易在人体皮肤、呼吸道、肠道等部位定植。对于自身免疫力低下的患者或长期应用免疫抑制剂的患者，机体防御功能弱，定植菌会转变为致病菌[3]。临床上治疗PA感染多采用碳青霉烯类、喹诺酮类、β-内酰胺类抗生素，尤其是碳青霉烯类抗生素具有超广谱特点，使其成为应用最多的抗生素。但随着碳青霉烯类抗生素应用频次增多和应用时间延长，PA对此类抗生素的耐药性也逐年升高，临床疗效逐渐下降，甚至部分患者呈现无可用有效抗生素的状态，严重影响临床治疗及患者的生存率[4]。PA的耐药机制包括PA作用靶位改变、PA产生灭活酶、外排泵、PA外膜通透性下降及形成生物被膜等[1]。黏液型PA外层包裹的生物被膜可阻碍抗生素向膜内渗透，导致药效下降甚至失效，引起PA感染治疗失败。PA感染多发生在需插管、手术、内镜等侵入性操作的危急重症患者及ICU、呼吸科、康复科等临床科室，这些科室治疗时间长、患者病程长且病情易反复，加上各类抗生素单独或联合使用较多，导致耐药PA菌株增多和流行。

本研究结果显示，黏液型PA总体耐药率达63.0%，且多药耐药率和广泛耐药率合计21.0%，表明黏液型PA耐药性处于较高水平。黏液型PA对碳青霉烯类抗生素耐药率达到25.0%，其中产碳青霉烯酶因素达到40.0%，表明产碳青霉烯酶是黏液型PA对碳青霉烯类耐药不可忽视的原因，但不是主要原因，主要原因可能是黏液型PA本身固有的耐药性、外膜Opr-D2蛋白缺失、外膜通透性下降、非特异性外排泵高表达、临床不合理用药、医院感染控制措施不当等

[2]。在黏液型PA所产碳青霉烯酶中，金属酶（B类碳青霉烯酶）是主要部分，占碳青霉烯酶的62.5%，而丝氨酸酶（A类碳青霉烯酶）是次要部分，仅占碳青霉烯酶的25.0%，提示通过检测产金属酶可间接反映产碳青霉烯酶的水平。碳青霉烯类耐药菌株主要来自ICU（占48.0%），其次为呼吸科、康复科等，该结果与李小菊等[4]报道情况基本一致。根据年代分布数据，耐碳青霉烯酶菌株数有随年增长趋势，提示云浮地区应重视黏液型PA的耐药性尤其是对碳青霉烯类抗生素的耐药性。

综上所述，云浮地区黏液型PA对抗生素的耐药率较高，且多药耐药率和碳青霉烯类耐药率不容忽视，通过检测PA产金属酶可间接反映碳青霉烯类耐药水平。

参考文献

[1]王巧媚,陆丹倩,赖贵龙,等.黏液型铜绿假单胞菌β-内酰胺酶的表达状况及耐药性研究[J].国际检验医学杂志,2020,41(13):1598-1601,1607.

[2]庞彩莲,刘敏娟,林景涛,等.东莞地区耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌的产酶情况及耐药性分析[J].海南医学,2021,32(21):2797-2799.

[3]郑琳,张帮林,刘育欣.某院2015—2017年黏液型铜绿假单胞菌耐药分析[J].中外医疗,2019,38(3):190-192.

[4]李小菊,许飞,刘洋.亚胺培南耐药铜绿假单胞菌产碳青霉烯酶耐药机制及其分子流行病学特征研究[J].抗感染药学,2019,16(2):190-195.

*云浮市医药卫生科研立项课题编号：2021B094