吴川市某养猪场猪繁殖与呼吸综合征的实验室诊断及分析

钟尚杰、黄其业

吴川市塘缀镇农业技术服务中心；广东吴川；524500

摘要: 对近日广东省吴川市某养猪场猪群出现的一例疑似猪繁殖与呼吸综合征进行实验室诊断与分析。将送检的5份仔猪与5份母猪的全血处理后，采用间接ELISA检测法、实时荧光定量PCR检测法、反转录PCR检测法对其进行实验室诊断，对其PCR扩增产物进行测序并利用DNAStar、MEGA等生物分析软件进行遗传进化分析。间接ELISA检测出母猪与仔猪全阳性，PCR检测出仔猪为阳性、母猪为阴性，测序分析结果表明感染的毒株为美洲型，与CH-1R株同源性为99.7%。该病例由PRRSV感染，所感染的毒株为美洲型，与CH-1R同源性最高。该诊断结果为养殖户对猪群采取相关的治疗手段以及免疫调整提供了依据，帮助猪场减少了经济损失。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征；实验室诊断；ORF5基因；序列分析

引言

猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的猪的一种高度接触性传染病，又称猪蓝耳病。该病临床主要表现的症状为妊娠母猪的繁殖障碍、妊娠母猪流产、弱胎、死胎、木乃伊胎，仔猪主要表现为间质性肺炎等症状 。根据基因型，可把该病分为美洲型与欧洲型两种；根据其临床表现，可将该病分为经典猪蓝耳病和高致病性猪蓝耳病[3] 。该病于1987年首次在美国发现，并迅速蔓延，形成一种流行病。目前，我国流行的主要是类高致病性毒株。PRRSV的毒株具有多样性与复杂性，容易发生变异，因此仍需加强该病的分析研究和综合防控，以此促进养猪业生产的稳定发展。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源和处理

疑似PRRS的临床病料来自于广东省吴川市某养猪场，共计10份，送检时间为2023年3月；采集的病料主要是患病母猪和仔猪的全血，送检后立即处理样品：用镊子取10个5 mL离心管，放于离心管架，将10份全血转移至离心管，以3000 r/min的转速离心2 min，取上层血清备用，将5份母猪的红细胞混样备用，将5份仔猪的红细胞混样备用。

1.1.2 主要试剂

PRRSV ELISA抗体检测试剂，磁珠提核酸试剂盒，PRRSV-U核酸检测试剂盒，cDNA第一链合成预混液，上下游引物，Green Nucleic Acid Dye染色液，TBE电泳缓冲液，天根D2000 DNA Marker。

1.1.3 主要仪器

单道移液器、多道移液器、自动酶标仪、全自动核酸提取仪、荧光PCR仪、普通PCR仪、核酸电泳仪、凝胶成像分析仪、电子天平。

1.1.4 分析软件

MEGA 11.0软件，DNAStar软件（Version 11.0）

1.2 方法

1.2.1 PRRS血清流行病学调查

本试验采取间接ELISA检测法。

使用前从冰箱取出试剂置于室温回温60 min，待所有试剂恢复至22~28 ℃后进行使用。在稀释板上加14孔245 μL样品稀释液，将处理好的血清每5 μL加到后10孔。在包被板上每孔加入100 μL稀释后样品，在A1、B1孔加入100 μL阴性对照血清，C1、D1孔加入100 μL阳性对照血清。盖上封膜板，22~28 ℃孵育30 min。等待孵育过程中将10倍洗涤液使用dd H2O进行10倍稀释，配制出1倍洗涤液30 mL。孵育结束后，弃去孔内液体，每孔加300 μL 1倍洗涤液，洗涤3次，记录并保存数据。

1.2.2 PRRS疑似病原核酸实时荧光定量PCR检测

取出预封装深孔板，撕去铝箔封口膜，在96深孔板的第2、8列加入20 μL Proteinase K和200 μL样本，将96深孔板放置于32通道自动核酸提取仪96深孔板底座上，再将磁棒套插入32通道自动核酸提取仪磁棒套架卡槽内，运行仪器，进行核酸提取。

提取结束后，取96深孔板第6、12列洗脱液每孔5 μL，加至配制好体系的PCR反应管中。将反应管放入PCR仪器，设置程序为50 ℃ 10 min，95 ℃ 2 min，1个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s（收集荧光），40个循环。剩余的核酸- 4 ℃保存备用。

1.2.3 PRRS疑似病原核酸反转录PCR检测

取2个PCR反应管，分别吸取4 μL cDNA第一链合成预混液、1 μL下游引物、8 μL dd H2O以及7 μL的模板RNA至PCR反应管中，放至普通PCR仪，设置反转录程序为42 ℃ 10 min，80 ℃ 10 min，1个循环，进行反转录。

另取2个PCR反应管，分别吸取4 μL mix、6 μL dd H2O、10 μL反转录出的cDNA至新的PCR反应管中，放至普通PCR仪，设置程序为95 ℃预变性5 min，95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，进行35个循环，72 ℃延伸7 min。

用电子天平称取0.375 g琼脂糖，配置凝胶液，趁热将凝胶液导入制胶槽中，插上梳子。等待胶液凝固30 min。凝固后小心将梳子拔出，将胶板放入乘有足量TBE的电泳槽中，加样孔一端朝向阴极。用微量加样器吸取7 μL样品和Marker加入到梳子空隙中。打开电源开关进行电泳，30 min后关闭电源。取出胶块置于紫外凝胶成像仪中进行观察。

1.2.4 反转录PCR扩增产物的序列分析

若PCR扩增产物在约603 bp处出现扩增条带，则与预期相符，将PCR扩增产物送至杭州洪桥中科基因技术有限公司进行基因测序，并用MEGA软件绘制进化树以及使用DNAStar软件中的MegAlign对其进行序列比对，鉴别PRRSV所属毒株。

2 结果

2.1间接ELISA检测法结果

判定依据：阳性对照OD值与阴性对照OD值的差值应大于或等于0.15时，可以进行结果判定。S/P的比值≥0.4时为阳性，S/P的比值≤0.4时为阴性，其中S=样品OD450 nm值－阴性对照OD450 nm平均值，P=阳性对照OD450 nm－阴性对照OD450 nm平均值。

5头母猪及5头仔猪的血清通过间接ELISA检测方法检测出S/P值均≥0.4（表3），判定结果为全阳性。

2.2 PRRS疑似病原核酸实时荧光定量PCR检测结果

判定依据：有扩增曲线并且Ct值≤35的为阳性，Ct值＞38或无Ct值显示的为阴性，35＜Ct值≤38的为可疑。

母猪1、母猪2、母猪3、母猪4、母猪5的混合核酸样品检测无Ct值，判定结果为阴性。仔猪1、仔猪2、仔猪3、仔猪4、仔猪5的混合核酸样品检测结果是Ct值为27.95，Ct值＜35且有扩增曲线，判定结果为阳性。

2.3 PRRS疑似病原核酸反转录PCR检测结果

经琼脂糖凝胶电泳后，母猪1、母猪2、母猪3、母猪4、母猪5的混合核酸样品无任何特异性条带出现判定结果为阴性；仔猪1、仔猪2、仔猪3、仔猪4、仔猪5的混合核酸样品扩增出一条603 bp的特异性条带，判定结果为阳性。

2.4 序列分析结果

反转录PCR的扩增产物在约603 bp出现了扩增条带，与预期相符，PCR扩增产物经杭州洪桥中科基因技术有限公司测序后，采用MEGA软件和DNAStar序列分析软件中的MegAlign程序将所测得的核苷酸序列与GenBank中由国内外上传的PRRSV典型15株PRRSV ORF5的核苷酸序列进行比对显示，该株与欧洲型毒株（LV、LENA）的核苷酸序列相似性为64.8%和62.5%，与美洲型毒株（VR2332、CH-1a、CH-1R、CHsx1401、HNyc15、JXA1、JXwn06、NADC30、R98、RFLP/RFLP1-4-4、TJ、TJbd14-1）的核苷酸序列的相似性为83.7~99.7%，其中，该株与CH-1R毒株的同源性最高，为99.7%。该毒株属于美洲型毒株，与CH-1R株亲缘关系最近。两个软件分析结果均表明所测核苷酸序列的毒株属于美洲型毒株，同时，该样品中PRRSV流行株与PRRSV CH-1R株亲缘关系最近。

3 讨论

在临床的防治运用上，想要对感染PRRS的病猪起到好的治疗效果，正确的诊断是关键。在本次诊断中，对该疑似PRRS的病例采取了间接ELISA的方法对其进行检测，阳性率为100%；同时，也采用了病毒核酸检测的方法，包括实时荧光定量PCR检测法以及反转录PCR检测法。样品检测出，仔猪混合核酸样品全为阳性，母猪混合核酸样品全为阴性，阳性率为50%。由此可知，ELISA试剂盒所带的蛋白与母猪疫苗免疫产生的抗体结合，与仔猪自然感染产生的病毒抗原结合，因此核酸检测所检测出的结果为仔猪阳性，ELISA所检测出结果为全阳性。在病毒核酸检测方法中，实时荧光定量PCR法具有更高的特异性、精确性和灵敏性，逆转录过程和定量PCR在一个反应管内一步完成，操作更为安全、简便、快捷，反转录PCR法相比荧光定量PCR更容易污染、操作更加繁琐，还可能存在非特异性扩增对结果造成干扰。间接ELISA检测法、实时荧光定量PCR与反转录PCR各有不同的用处以及优点和缺点，在实际应用中，要考虑不同技术的应用情形，综合考虑不同方法的应用特点，采取合适的方法进行应用。

PRRSV是一种有囊膜的单股正链RNA病毒，其基因组极其容易发生变异，可通过碱基突变、缺失和基因重组等方式发生变异，其中碱基突变最为多见；PRRSV容易发生变异的特点以及新毒株经不同途径传入猪场，都会造成多种不同的毒株在我国共存的局面。因此，可以利用基因测序的手段对PRRSV进行遗传进化分析、研究病毒演化规律，以此为研发新毒株的疫苗提供理论依据，也可为养殖场的养殖户及时采取免疫措施提供科学依据，对预防PRRS具有重要意义。在本次检测中，把反转录PCR所扩增的片段进行基因测序，将其与GenBank中由国内外上传的常见毒株的PRRSV ORF5的核苷酸序列进行比对，根据其同源性分析矩阵图以及进化树显示，所测的感染毒株为美洲型，与PRRSV CH-1R株的同源性最高。据了解，该养猪场后续对猪场的猪群采取了相应的治疗措施并注射PRRSV CH-1R株的疫苗，有效控制住了病情。通过本次检测结果，养殖场能更具有针对性地对猪群采用合适的疫苗，及时地控制疫病，减少了大量经济损失，若仅靠上述的血清学检测、实时荧光定量PCR、反转录PCR的检测方法，只能诊断出所患疾病，无法判断病毒具体所属毒株并针对性用苗，基因测序的方法很好地解决了这一问题，在实际运用中更具有针对性。

参考文献

[1]王红宁,廖德惠.规模化养猪主要传染病研究新进展[J].四川畜牧兽医,1996(03):54-57.

[2]陈溥言.兽医传染病学.5版. [M].北京:中国农业出版社, 2006:226.

[3]张硕. 猪繁殖与呼吸综合征病毒分离株遗传进化分析及通用实时荧光RT-PCR检测方法的建立和应用[D].北京:中国农业大学,2017:1-6.

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