论著

通讯作者个人简介   

姓名：王建军

1、性别：男

2、出生年月：1972年07月

3、民族:汉族

4、籍贯：黑龙江省哈尔滨市南岗区

5、学历：大学本科（医学学士）

6、职称：外科副主任医师

7、职务：副所长（副院长）

8、研究方向 ：监管医学外科专业

9、科室：医院领导

10、单位 ：北京市利康医院

11、邮箱 ：[e-mail]

12、邮编：102609

13，单位级别：正处级单位

参照酪氨酸联合半胱氨酸对小鼠肝脏UCP1代谢的影响研究戒毒人员膳食营养结构

马哲 王建军通讯作者

北京市利康强制隔离戒毒所  北京 102609

摘要：本文初步探究酪氨酸联合半胱氨酸对小鼠肝脏解偶联蛋白1（UCP1）表达的影响。本文旨在研究基础日粮中补充不同浓度酪氨酸和半胱氨酸对小鼠肝脏脂质代谢的影响以及探究如何治疗肥胖症的新方法。结果表明，饲料添加组小鼠的血清中，总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇明显减少，相关因子PRDM16，PGC-1α，PPAR-γ，UCP1含量升高。最终结果表明，膳食补充剂酪氨酸联合半胱氨酸可以在室温下通过促进相关因子的升高，对机体起到减肥的作用。在戒毒医疗工作实践中可以根据该实验结果，帮助戒毒人员管理身材，有序回归社会。

关键词：酪氨酸；半胱氨酸；戒毒医疗；脂质代谢；肥胖症

ABSTRACT: This paper preliminarily explored the effect of tyrosine and cysteine on the expression of uncoupling protein 1 (UCP 1) in mouse liver. This paper aims to study the effects of basic dietary supplementation with different concentrations of tyrosine and cysteine on mouse liver lipid metabolism and to explore new ways of understanding how to treat obesity. The results showed that total cholesterol, triglyceride and LDL cholesterol were significantly decreased, and the related factors PRDM16, PGC-1 α, PPAR- γ, and UCP 1 were increased. The final result shows that the dietary supplement tyrosine combined with cysteine can reduce the body by promoting the increase of related factors at room temperature.

Keywords: tyrosine; cysteine; UCP1; lipid metabolism; obesity

引言

强制隔离戒毒人员因在强制隔离戒毒所内开展戒治，受其生活、饮食和戒治特点所致，加之生理上离开毒品所造成的戒断反应，绝大多数戒毒人员体重都会增加，造成肥胖。待戒毒人员解除强制隔离戒毒时，会因身形肥胖，失去自信，无法在短时间内融入社会，对生活失去目标和拼搏奋斗的勇气，重新走上吸食毒品的道路，不利于社会的健康发展。

在本研究中，首先观察酪氨酸联合半胱氨酸日粮在连续饲喂一个月的条件下各对照组小鼠肝脏组织HE染色和油红O染色切片的变化；其次检测了各对照组小鼠的总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白的变化情况；最后检测了酪氨酸联合半胱氨酸日粮在连续冷饲喂一个月的条件下各对照组小鼠肝脏组织中PRDM16；PGC1-α，PPAR-γ和UCP1的表达情况，探讨不同添加浓度的酪氨酸联合半胱氨酸日粮对肝脏中PRDM16；PGC1-α，PPAR-γ和UCP1表达的影响。

1 材料与方法

1.1主要试剂及仪器

表1-1 主要试剂及仪器

甘油三脂（TC）测试盒	南京建成公司
总胆固醇(TG)测试盒	南京建成公司
高密度脂蛋白（HDL-C）测试盒	南京建成公司
低密度脂蛋白(LDL-C)测试盒	南京建成公司
电子显微镜	日本奥林巴斯公司
BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型）	上海碧云天公司
SDS-PAGE凝胶试剂盒	上海碧云天公司
SDA-PAGE蛋白上样缓冲液（5X）	上海碧云天公司
蛋白marker	MILLIPORE公司
底物发光液	MILLIPORE公司
PVDF膜	MILLIPORE公司
PGC-1α鼠多克隆抗体	Proteinch公司
PRDM16兔单克隆抗体	Proteinch公司
PPAR-γ兔单克隆抗体	Proteinch公司
UCP1兔单克隆抗体	Proteinch公司
HRP标记的山羊抗兔IgG	Proteinch公司
HRP标记的山羊抗鼠IgG	Proteinch公司
β-Tubulin 兔多克隆抗体	abcam公司
化学发光数字成像系统	美国Bio-rad公司
基础型电泳仪	美国Bio-rad公司
实验室震动球磨仪	北京旭鑫盛科仪器设备有限公司
4℃离心机	德国艾本德公司

1.2 实验动物

SPF级C57小鼠，雄性，3周龄，体重14-16g，购于辽宁省长生生物技术股份有限公司。预饲一周，并将其分为分为室温对照组和1%、3%、5%膳食补充剂组，每组8只，并在12 h昼夜交替光照，自由饮水，室温（27±2℃）的条件饲中养，一个月后进行断颈处死。

1.3 实验饲料

Cys纯度99.66%，Tyr纯度＞98%，购于浙江一诺生物科技有限公司。1%鼠粮（添加额外的1%酪氨酸、半胱氨酸联合鼠粮），3%（添加额外的3%酪氨酸、半胱氨酸联合鼠粮），5%（添加额外的5%酪氨酸、半胱氨酸联合鼠粮）。

1.4 实验方法

1.4.1 血液生化指标检测

小鼠禁食12 h，眼球采血1~2 mL，3000 rpm/min离心10分钟，提取血清。按试剂盒说明，血清TC与TG采取酶比色法进行测定，HDL-C与LDL-C采取清除法进行测定。

1.4.2 小鼠肝脏的形态学分析

将各组的小鼠肝脏放入4%的多聚甲醛液中固定24 h，随后用酒精进行梯度脱水，最后用石蜡进行包埋，切片5 μm厚，采用HE（苏木精-伊红）染色，并在200倍的物镜下观察各组小鼠肝脏的形态。

1.4.3 UCP1蛋白表达水平的检测

表1-2 Western Blot 主要操作步骤

组织总蛋白的提取
第一步	称取一定量的肝脏组织置于1.5 mL离心管中，做好标记并加入250 μL含有PMSF的NP40裂解液（PMSF的终浓度为1 mM）
第二步	向每个离心管加入5颗钢珠，随后放入提前预冷混合型球磨仪中进行充分研磨，可适当延长研磨时间
第三步	组织充分研磨呈匀浆态后，置于4℃冰箱中裂解30 min
第四步	裂解完成后，将1.5 mL离心管放入预冷的4℃离心机中，12 000 rpm离心10 min。离心完成后，取上清至新的1.5 mL离心管中
组织总蛋白浓度的测定及样品制备
第一步	根据BCA试剂盒所述方法及步骤测定总蛋白浓度
第二步	根据标准曲线计算各总蛋白浓度。取裂解的总蛋白溶液与5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液及PBS缓冲液按一定比例混合均匀，使总蛋白终浓度达到一致。然后将离心管放入水浴锅中100℃煮沸10 min使蛋白质变性，冷却至室温后，-80℃保存备用。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
第一步	根据所需蛋白分子量的不同选择合适的下层分离胶浓度，上层浓缩胶浓度为10%
第二步	将预制胶板插在电极柱上，正负极校对好后放置在电泳槽中，加入适量的电泳缓冲液。两手均匀用力缓慢拔出制胶梳子，向加样孔中加入蛋白样品，在蛋白样品两边加入Marker
第三步	电泳条件：恒压电泳，首先50V 30min、80 V 30 min，待蛋白条带从浓缩胶进入到分离胶后改电压数为120 V约40 min
湿转转膜
第一步	电泳结束后从电泳槽中取出胶板，然后用塑料切板将短玻璃板撬起，切去浓缩胶部分
第二步	根据待转凝胶尺寸裁剪适合孔径及大小的PVDF膜，将PVDF膜放入甲醇溶液中浸泡激活1 min
第三步	将湿转转印夹放置于转膜缓冲液的托盘中，然后将转印海绵置于转印夹上，按照以下顺序依次放置滤纸-待转凝胶-PVDF膜-滤纸-转印海绵（“三明治”结构），最后夹紧转印夹
第四步	将湿转槽放入冰盒中，采用100 V恒压进行湿转，转膜时长由待转蛋白分子量和PVDF膜孔径大小决定
封闭
第一步	配制5 %脱脂奶粉的封闭液：1×TBST缓冲液100 mL与5 g脱脂奶粉搅拌混匀，放置4 ℃冰箱备用
第二步	湿转结束后，取出PVDF膜，放入5 %脱脂奶粉的封闭液中在摇床上室温孵育1 h
免疫反应
第一步	封闭结束前，按照抗体说明书稀释比例配制一抗。封闭结束后洗去残留的脱脂奶粉，然后将PVDF膜放入装有对应一抗的抗体孵育盒中，置于4℃冰箱中的脱色摇床上摇动过夜
第二步	第二天将一抗回收，用1×TBST缓冲液洗涤PVDF膜5次，每次5 min
第三步	配制二抗，洗涤结束后，把PVDF膜转移至含有二抗的抗体孵育盒中，放置摇床上室温孵育1 h；孵育结束后，1×TBST缓冲液洗涤5次，每次5 min
ECL化学发光显影
第一步	提前打开凝胶成像系统和电脑，并按说明书配制成ECL显影液
第二步	二抗洗涤结束后，将PVDF膜放置在成像系统操作板上，均匀滴加ECL显影液。
第三步	将扫描结果图像保存并做好记录，待后续统计分析

1.4.4 统计学分析

使用spss26.0统计软件进行数据的统计分析，实验结果采用平均数±标准差表示（±s）。各组间两两比较采用t检验，P<0.05表示差异具有显著性。

2 结果

2.1 肝脏组织形态学的变化

图2-1-1肝脏油红切片（ 20◊10）

A：Rt组B：1%Rt组C：3%Rt组D：5%Rt组

图2-1-2 肝脏油红切片（ 40◊10）

E：Rt组F：1%Rt组G：3%Rt组H：5%Rt组

在肝组织切片中，肝细胞内细胞核颜色显蓝色而脂肪滴颜色显红色。油红O染色结果表明，常温无氨基酸添加组肝脏的脂肪滴最多，随着添加的氨基酸浓度增高，肝脏组织中的脂肪滴随之减少，其中，5%酪氨酸联合半胱氨酸添加组中的脂肪滴最少。

2.2 小鼠肝脏血脂水平

图2-2-1 血脂四项的变化

当机体TC、TG和LDL随着氨基酸添加的浓度升高而逐渐降低，而HDL随着氨基酸添加的浓度升高而升高时促进其小鼠肝脏UCP1代谢。

2.3 UCP1等相关蛋白表达水平

图2-3-1Western blot检测各组肝脏中相关蛋白表达水平

Western blot结果显示，与Rt组相比，各浓度梯度的酪氨酸联合半胱氨酸添加组的PRDM16，PGC-1α，PPAR-γ和UCP1的含量均有升高，其中5%日粮添加组差异最为显著。

3 讨论

本文通过对血脂水平的检测得出在酪氨酸联合半胱氨酸和未采用酪氨酸联合半胱氨酸对小鼠肝脏UCP1代谢变化。通过实验结果表明与无氨基酸的Rt组相比，各对照组的TC和TG均有所下降，其中以5%日粮添加组下降最明显；高密度脂蛋白胆固醇指标随着氨基酸添加的浓度升高而升高，其中以5%日粮添加组最为明显。最终，当机体TC、TG和LDL随着氨基酸添加的浓度升高而逐渐降低，而HDL随着氨基酸添加的浓度升高而升高时可有效促进其小鼠肝脏UCP1代谢。

4 结论

结合戒毒人员的行为、心理和生理特点，在戒毒人员进行戒毒期间，可对其伙食营养膳食结构进行干扰，在保证其营养平衡、满足治疗和戒治需求的同时，在日常饮食中可添加含量为5%酪氨酸联合半胱氨酸的食物，有助于帮助戒毒人员维持体重，促使其以阳光、积极、自信的心态面对戒治生活和回归社会后的生活，使其保持操守，降低复吸率。

参考文献

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[2]侯丽萍.FGF21介导氧化苦参碱改善高脂诱导胰岛素抵抗及肝脏糖脂代谢紊乱的研究[D].河北医科大学,2019.

[3]张榕,刘春华,胡爽,李鹏翔,魏守刚.夜间光暴露小鼠肝脏非靶向代谢组学研究[J].预防医学,2021,33(02):130-134.

[4]刘晓云.几种酪氨酸激酶抑制剂的代谢和临床药动学研究[D].中国科学院大学(中国科学院上海药物研究所),2020.

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[8]孙珍珍,彭川,郑金英,等.甲硫氨酸负荷致同型半胱氨酸轻度升高对大鼠肝脏脂质代谢的影响及机制研究[J].上海交通大学学报(医学版),2015,35(07):983-989.

通讯作者个人简介

姓名：王建军

1、性别：男

2、出生年月：1972年07月

3、民族:汉族

4、籍贯：黑龙江省哈尔滨市南岗区

5、学历：大学本科（医学学士）

6、职称：外科副主任医师

7、职务：副所长（副院长）

8、研究方向 ：监管医学外科专业

9、科室：医院领导

10、单位 ：北京市利康医院

11、邮箱 ：[e-mail]

12、邮编：102609

13，单位级别：正处级单位