黄芪提取物长期毒性研究

赵雪王芳

内蒙古卫生职业技术学校  内蒙古呼和浩特 010050

【摘要】目的探讨黄芪提取物长期服用的安全性研究。方法采用限量法的雌、雄性大鼠急性经口毒性试验，细菌回复突变试验、哺乳动物红细胞微核试验、体外哺乳类细胞染色体畸变试验，90天经口毒性试验。结果采用限量法，在本试验条件下黄芪提取物雌、雄性大鼠急性经口毒性试验的LD50大于20.0g/kg·BW，根据急性毒性剂量分级标准，该样品属实际无毒级；细菌回复突变试验、哺乳动物红细胞微核试验、体外哺乳类细胞染色体畸变试验结果均为阴性；黄芪提取物以2g/kg·BW、4g/kg·BW 和6g/kg·BW的剂量经口给予大鼠90天，受试动物一般情况良好，体重、食物利用率、脏器重量、脏器系数均无异常改变；眼部检查未发现异常变化；尿液指标、血液学指标及生化指标结果显示，各项指标均在正常范围；各脏器病理组织学检查均未见与受试样品有关的病理改变。结论黄芪提取物长期服用具有安全性。

关键词：黄芪提取物；毒性

黄芪属于中医传统的补虚药，历史悠久，具有很高的营养和药用价值，可应用于多种疾病的保健康复与辅助治疗［1，2］。黄芪的成分黄芪皂苷具有抗炎、镇痛、降压、降糖、镇静等药理作用，将黄芪中提取的生物活性物质进行加工研发保健食品，可有效提高其成分的摄入量和作用效果，具有较好的开发和利用价值。已有多篇报道指出，黄芪具有安全性较高的特点。但国内外对黄芪的醇提安全性研究比较少，本文旨在研究黄芪提取物的食用安全性。

1试验材料

1.1试验药物：黄芪提取物，黄芪经65%乙醇回流提取3次，过滤、合并滤液、浓缩、喷雾干燥得黄芪提取物，提取率约10%，人体推荐剂量1.2g/人/d。

1.2实验动物：SPF级健康离乳SD大鼠，雌雄各半；清洁级ICR小鼠，雌雄各半。

2 试验方法

2.1急性经口毒性试验：采用限量法，选用体重为180-220g的SPF级健康离乳SD大鼠20只，雌雄各半。急性经口毒性剂量为20.0g/kg·BW。给样后连续观察14天，记录中毒表现及死亡情况。期间每周称量一次体重。

2.2 细菌回复突变试验：按GB 15193.4—2014 食品安全国家标准细菌回复突变试验要求，采用经鉴定符合要求的鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535五株菌株进行试验。首次试验采用平板掺入法、证实试验采用预培养平板掺入法。采用β-萘黄酮和苯巴比妥钠诱导的大鼠肝S9作为体外代谢活化系统。首次试验剂量设为5000μg/皿、1500μg/皿、500μg/皿、150μg/皿和50μg/皿，同时设自发回变、溶剂对照和阳性突变剂对照，通过首次试验确定受试物的溶解度与细菌毒性。根据首次试验结果设定证实试验的剂量设为5000μg/皿、1500μg/皿、500μg/皿、150μg/皿和50μg/皿。样品置于0.103Mpa条件下高温灭菌20min，在无菌条件下，称量受试样品并配制成溶液，受试样品用无菌水配制成50mg/mL，即高剂量组，用无菌水按一定倍比逐级稀释配制成15、5、1.5、0.5mg/mL4个剂量组。

2.3 哺乳动物红细胞微核试验：按GB 15193.5—2014 食品安全国家标准哺乳动物红细胞微核试验要求，选用体重25～35gICR种小鼠50只，动物购买后适应环境3天进行试验。按体重随机分为5个组，每组10只，雌雄各半。受试样品最高剂量设10.0g/kg.BW，中、低剂量设5.0g/kg.BW、2.5g/kg.BW，同时设溶剂对照组，40mg/kg·bw环磷酰胺为阳性对照组，采用30h给受试物法两次给受试样品间隔24h，第二次给受试样品后6小时处死动物，取胸骨常规制片、镜检。每鼠计数2000个骨髓嗜多染红细胞（PCE），观察含微核的嗜多染红细胞数并计算微核发生率，以千分率计。每鼠计数200个嗜多染红细胞时所观察到的成熟红细胞数（NCE），并计算嗜多染红细胞与总红细胞比值（PCE/RBC）。

2.4 体外哺乳类细胞染色体畸变试验：按GB 15193.23—2014 食品安全国家标准体外哺乳类细胞染色体畸变试验要求，选用中国仓鼠肺（CHL）细胞株。据细胞毒性和受试样品溶解情况，选择5000、2500、1250µg/mL3个剂量组进行染色体畸变试验。在无代谢活化条件下，采用直接致突变物丝裂霉素做为阳性对照物，浓度为0.25μg/mL；在有代谢活化条件下，采用间接致突变物环磷酰胺做为阳性对照物，浓度为15μg/mL。试验前一天，将一定数量的细胞接种于培养皿中，放CO2培养箱内培养。试验时，吸去培养皿中的培养液，加入一定浓度的受试物、S9mix（不加S9 mix时，需用培养液补足）以及一定量不含血清的培养液，放培养箱中处理3h。处理结束后，吸去含受试物的培养液，用PBS溶液洗细胞3次，加入含10%

胎牛血清的培养液，放回培养箱,于24 h收获细胞。于收获前4h，加入细胞分裂中期阻断剂秋水仙素，作用时间为4h，终浓度为1μg/mL。收获的细胞经消化、低渗、固定后滴片、染色以备阅片。在油镜下阅片，每一个剂量组应分析不少于100个分散良好的中期分裂相。

2.5 90天经口毒性试验：按GB 15193.13—2015 食品安全国家标准90天经口毒性试验要求，选用体重80±5gSPF级健康离乳SD大鼠80只，雌雄各半，动物购买后适应环境3天进行试验。按体重随机分为4个组，每组10只，雌雄各半。受试样品按人体推荐剂量的100、200、300倍即2、4和6g/kg·BW给予，同时设溶剂对照组，每日经口灌胃一次，连续90d。每天观察并记录动物的一般表现、行为、中毒表现和死亡情况。每周称1次体重和2次食物摄入量。计算动物增重、摄食量、食物利用率等，在试验前和试验结束时，至少对高剂量组和对照组大鼠进行眼部检查。若发现高剂量组动物有眼部变化，则应对所有动物进行检查。测定血常规、生化等血液学指标。大鼠在试验结束时进行尿液常规检查，实验结束将动物处死并进行大体解剖，肉眼观察有无异常，称量并计算脏体比值，进行主要组织病理学检查。

2.6 数据处理：采用SPSS11.0统计软件对数据分别进行One-way ANOVA分析及Dunnett检验，检验水准α=0.05。

3结果

3.1 大鼠急性经口毒性试验：在14d观察期内，雌、雄大鼠外观均正常，四肢活动正常，无死亡。剖检未出现肉眼可见病变。获得雌雄大鼠黄芪提取物急性经口毒性试验LD50＞20.0g/kg·BW。根据急性毒性分级标准，将其判定为无毒级物质。

3.2遗传毒性试验：细菌回复突变试验、哺乳动物红细胞微核试验、体外哺乳类细胞染色体畸变试验结果均为阴性。

3.3 90天经口毒性试验：

3.3.1 一般情况观察：各组动物生长发育、活动均正常，大鼠毛发光润，摄食、饮水、粪便均正常。无中毒表现和死亡。

3.3.2对大鼠体重、增重及食物利用率的影响以2g/kg·BW、4g/kg·BW和6g/kg·BW三个剂量的黄芪提取物经灌胃给予大鼠，连续90天。与阴性对照组相比，各剂量组动物每周体重、体重增加量、进食量和食物利用率均无统计学差异（P>0.05）。90天喂养结束时，与阴性对照组相比各剂量组动物总体重增加量、总进食量和总食物利用率均无统计学差异（P>0.05）。

3.3.3眼部检查：在试验前和试验结束时，对高剂量组和对照组大鼠进行眼部检查。未发现高剂量组和对照组动物有眼部异常变化。

3.3.4大鼠尿常规指标：经口给予大鼠不同剂量的黄芪提取物90天，测定大鼠尿常规指标。结果各剂量组尿常规指标与阴性对照组相比，均无统计学差异（P>0.05）。

3.3.5大鼠血液学指标：经口给予大鼠不同剂量的黄芪提取物90天，测定各剂量组大鼠血液红细胞计数、血红蛋白水平、白细胞计数及其分类等指标、红细胞压积、血小板计数等指标。结果各剂量组的各指标与阴性对照组相比，均无统计学差异（P>0.05），结果见表1。

表1黄芪提取物对大鼠血液学指标的影响(±s)（n=10）

性别	检验项目	剂量  (g/kg·BW)
		对照组	2	4	6
雄	白细胞计数(×109/L)	6.76±2.51	7.02±3.01	6.77±2.41	6.89±4.05
	红细胞计数(×1012/L)	7.58±0.32	7.46±0.28	7.39±0.43	7.51±0.33
	血红蛋白(g/L)	141±2	142±5	143±4	144±3
	血球压积（%）	43.1±1.2	42.7±1.6	44.2±2.1	43.7±1.7
	血小板（109/L）	917±93	925±88	920±91	915±101
	淋巴细胞(％)	76.8±2.4	75.3±2.2	77.3±1.7	76.5±3.2
	中性细胞(％)	8.5±2.2	8.7±1.5	8.3±1.9	8.4±2.6
	单核细胞(％)	4.26±1.17	4.35±1.05	4.12±0.95	4.28±0.88
	嗜酸性细胞(％)	1.51±0.25	1.45±0.16	1.58±0.32	1.59±0.26
	嗜碱性细胞(％)	0.15±0.05	0.16±0.04	0.15±0.03	0.17±0.06
雌	白细胞计数(×109/L)	5.78±3.34	6.11±3.16	6.26±2.86	6.34±3.33
	红细胞计数(×1012/L)	7.64±0.32	7.59±0.24	7.73±0.27	7.49±0.31
	血红蛋白(g/L)	138±3	142±4	139±2	141±5
	血球压积（%）	42.4±0.9	42.6±1.1	43.1±2.0	43.5±1.8
	血小板（109/L）	895±76	906±83	916±88	903±91
	淋巴细胞(％)	75.1±2.2	74.6±1.7	76.3±1.9	76.8±2.3
	中性细胞(％)	8.2±2.1	7.9±2.0	8.3±1.8	7.8±2.4
	单核细胞(％)	4.18±1.04	4.25±0.97	4.33±1.14	4.19±1.07
	嗜酸性细胞(％)	1.53±0.22	1.51±0.24	1.49±0.19	1.52±0.25
	嗜碱性细胞(％)	0.14±0.05	0.16±0.04	0.15±0.03	0.16±0.04

3.3.6大鼠血液生化指标：经口给予大鼠不同剂量的黄芪提取物90天，测定各剂量组大鼠血清丙氨酸氨基转移酶、门冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、谷氨酰转肽酶、尿素、肌酐、血糖、总蛋白、白蛋白、总胆固醇、甘油三酯、氯、钾、钠的水平。结果各剂量组的各指标与阴性对照组相比，均无统计学差异（P>0.05），结果见表2。

表2 黄芪提取物对大鼠血液生化指标的影响(±s)（n=10）

性别	检验项目	剂量  (g/kg·BW)
		对照组	2	4	6
雄	丙氨酸氨基转移酶(U/L）	31±4	30±5	29±3	31±4
	门冬氨酸氨基转移(U/L)	116±10	115±11	113±15	118±7
	总蛋白(g/L)	68.3±2.3	66.5±3.1	67.3±2.8	67.8±3.5
	白蛋白(g/L)	33.1±0.7	32.6±1.5	31.9±0.9	33.2±1.2
	碱性磷酸酶(U/L)	141.3±38.6	139.7±33.5	144.1±40.1	137.3±35.1
	谷氨酰转肽酶(U/L)	0.23±0.24	0.25±0.21	0.26±0.19	0.26±0.14
	血糖(mmol/L)	5.09±0.69	5.15±0.77	4.86±0.83	4.75±0.53
	尿素(mmol/L)	4.61±0.47	4.50±0.69	4.52±0.45	4.43±0.72
	肌酐(μmol/L)	39±4	38±5	36±4	37±3
	总胆固醇(mmol/L)	1.60±0.32	1.49±0.25	1.54±0.27	1.51±0.33
	甘油三酯(mmol/L)	0.94±0.25	0.93±0.17	0.89±0.22	0.86±0.15
	钾离子(mmol/L)	4.93±0.34	4.95±0.41	5.02±0.29	5.14±0.46
	钠离子(mmol/L)	138.6±1.2	139.2±1.1	137.7±1.4	139.6±1.7
	氯离子(mmol/L)	98.0±1.3	97.7±0.8	97.6±1.3	98.6±0.9
雌	丙氨酸氨基转移酶(U/L）	24±4	23±7	26±6	25±5
	门冬氨酸氨基转移(U/L)	126±14	120±11	123±17	125±16
	总蛋白(g/L)	70.2±1.9	71.4±3.1	72.8±4.0	72.6±2.7
	白蛋白(g/L)	35.2±0.9	35.5±1.5	33.9±1.3	34.3±0.8
	碱性磷酸酶(U/L)	107.3±31.2	111.1±28.6	117.5±33.2	108.6±40.1
	谷氨酰转肽酶(U/L)	0.37±0.34	0.38±0.35	0.34±0.21	0.35±0.26
	血糖(mmol/L)	5.41±0.82	5.30±0.62	5.53±0.73	5.27±0.93
	尿素(mmol/L)	5.72±0.90	5.82±0.77	5.79±0.54	5.63±0.62
	肌酐(μmol/L)	44±3	43±4	43±4	42±6
	总胆固醇(mmol/L)	1.91±0.28	2.05±0.23	1.84±0.32	1.93±0.27
	甘油三酯(mmol/L)	0.73±0.16	0.68±0.26	0.76±0.17	0.82±0.23
	钾离子(mmol/L)	4.65±0.24	4.71±0.31	4.82±0.18	4.95±0.22
	钠离子(mmol/L)	138.1±1.3	135.2±1.3	136.5±1.7	137.7±1.5
	氯离子(mmol/L)	97.6±0.8	96.9±0.9	97.3±1.1	97.2±1.3

3.3.7大体病理及组织学检查：经口给予大鼠不同剂量的黄芪提取物90天，测定各组大鼠心脏、胸腺、肾上腺、肝脏、肾脏、脾脏、睾丸、卵巢绝对重量及相对重量（脏/体）。结果各剂量组的各指标与阴性对照组相比，均无统计学差异（P>0.05）。各剂量组雌雄大鼠大体解剖观察均未见异常改变。大体解剖观察未发现与受试样品有关的组织病理学改变。

4结论

本研究针对黄芪提取物长期食用安全性进行了研究，采用限量法，在本试验条件下黄芪提取物雌、雄性大鼠急性经口毒性试验的LD50大于20.0g/kg·BW，根据急性毒性剂量分级标准，该样品属实际无毒级；细菌回复突变试验、哺乳动物红细胞微核试验、体外哺乳类细胞染色体畸变试验结果均为阴性；本试验黄芪提取物以2g/kg·BW、4g/kg·BW和6g/kg·BW的剂量给予大鼠90天，受试动物一般情况良好，试验结束时雌雄大鼠体重、总增重、总摄食量及总食物利用率与对照组比较均无显著性差异（P＞0.05）；脏器重量、脏器系数均无异常改变；眼部检查未发现异常变化；尿液指标、血液学指标及生化指标结果显示，各项指标均在正常范围；各脏器病理组织学检查均未见与受试样品有关的病理改变。表明黄芪提取物连续灌服90天对SD大鼠无不良影响。为黄芪提取物应用于保健食品原料安全性提供了依据。

参考文献

[1] 王玲丽，丰华玲，杨柯，等．黄芪生物学及化学成分研究进展［J］．基因组学与应用生物学，2017，36(6):2581－2585． ［2］杨庆珍，王增绘，付娟，等．黄芪化学成分及生态因子的相关性［J］．应用生态学报，2015，26(3):732－738．