氢分子干预慢性阻塞性肺疾病大鼠的机制研究

田梓丁1# 王俞杰1# 曹煜1 张智杰1王志远2 隋宏书3 *

（1.山东第一医科大学临床与基础医学院，济南 2.山东第一医科大学临床与基础医学院人体解剖学系，济南3.山东第一医科大学临床与基础医学院组织学与胚胎学系，济南）

【摘要】

目的：探究氢分子对慢性阻塞性肺疾病大鼠的干预保护作用。方法：30只雄性SD大鼠随机抽取10只为对照组，其余大鼠每日2次暴露于香烟烟雾内,每次30min，进行12周。接受烟熏的大鼠分别于第1天，第28天和第56天经鼻腔滴注脂多糖0.5ml（lg/L)，对照组用同样办法滴加等量生理盐水。自造模日起每周记录大鼠的外观表型，56d后取肺组织观察可见大鼠肺组织呈明显COPD相关表现即为建模成功。建模成功的小鼠随机分为两组，其中一组每日接受氢氧混合气（氢气67%；氧气33%）治疗2周，每次1h，2次/d。对照组每日接受等量等时长的氧气空气混合气吸入。完成治疗实验后，测量每组大鼠的体质量，处死后取大鼠肺组织，HE染色法观察大鼠肺脏组织形态，测定肺脏组织GSH含量。结论：氢分子可以改善COPD大鼠肺组织的氧化应激损伤，干预COPD。

  关键词：COPD；氢分子；氧化应激

中图分类号: Q813.7            文献标识码：A

第一作者：田梓丁，2019级临床医学本科专业在读本科生

共同第一作者：王俞杰，2020级临床医学本科专业在读本科生

通讯作者: 隋宏书， E-mail:[e-mail]

基金资助：山东第一医科大学校级大学生创新创业训练计划项目（No.2022104391100）

1. 前言

COPD是以气流阻塞为特点的慢性支气管炎和/或肺气肿，易导致肺心病、呼吸衰竭等严重并发症，是呼吸系统最常见的疾病之一。目前，较为认可的发病机制主要有炎性机制、氧化应激机制等[1]。由于其发病机制的复杂性，临床实际治疗情况不容乐观，尚无明确治疗靶点和合理广泛的治疗方案[2]，现有治疗手段大多集中在改善患者症状，提高生存质量方面。因此，本项目将着重探索新的可行治疗方案，旨在为临床上慢阻肺的治疗提供新思路和策略。现已有研究报道氢气作为抗氧化剂在氧化应激相关的多种疾病中发挥保护作用[3]，但目前未能完全明确氢气的具体作用机制，现阶段实验研究发现可能与氢气调节多种细胞信号通路，增强抗炎因子表达，抑制促炎和促凋亡细胞因子的释放从而发挥抗氧化作用，减轻炎症损伤有关［4］。目前，许多研究已证实氢气对肺恶性肿瘤[5]、支气管哮喘[6]等多种呼吸系统急慢性损伤具有潜在保护作用。鉴于此，本项目在前期研究的基础上，以氢分子为切入点，以大鼠为动物模型，采用脂多糖联合烟熏的方法构建大鼠慢阻肺模型，从大鼠的体质量增长情况、肺组织病理变化、肺组织中相关氧化应激指标情况等方面入手，探讨氢分子对慢阻肺大鼠的干预作用。

2.材料与方法

2.1 实验动物

  购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，大鼠品系SD，清洁级；8周龄

2.2 造模与分组

选用起始健康状态、大小体重相近的雄性大鼠30只，适应性喂养一周后开始实验。随机取10只做为对照组，其余大鼠置于烟箱内行被动吸烟处理,2次/d，每次0.5h，进行12周。接受烟熏的大鼠分别于第1天，第28天和第56天鼻腔滴注脂多糖0.5ml（lg/L)，对照组采用同样办法滴加等量生理盐水。自造模日起每周记录大鼠外观表型，56d后取大鼠肺组织观察可见其肺组织呈明显COPD样改变即为建模成功。建模成功的大鼠随机等分为COPD组和COPD+氢分子干预组，后者每日接受氢氧混合气（氢气67%；氧气33%）治疗2周，每次1h，2次/d。对照组每日接受等量等时长的氧气空气混合气吸入。

2.2.1 观察指标及方法

  实验前后，每组大鼠测量体质量，处死后取大鼠肺组织，部分用4%多聚甲醛固定，制成组织切片；部分置入液氮中速冻，-80℃保存，用于后续实验；

2.2.2 HE染色法观察肺组织形态

固定的肺组织制成病理切片，光镜下观察肺脏组织形态变化。

2.2.3 ELISA法测肺组织GSH含量

  按试剂盒说明测定肺组织GSH含量。

2.2.4 统计学方法

每次实验至少重复进行3次，实验数据的处理均由SPSS17.0软件分析，作图软件选用 GraphPadPrism 5.0；计量资料以(mean±SE )表示。两组数据比较采用独立样本t检验；3组或3组以上的多样本间的数据比较采用单因素方差分析，多重比较使用LSD方法。如不符合单因素方差分析的条件则采用秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 光镜下各组大鼠肺脏组织病理变化

图1. 各组大鼠肺脏组织病理变化（H&E）

1. 对照组；   B. COPD组；  C. 氢分子干预组

镜下可见对照组大鼠气道上皮结构正常，纤毛整齐，肺泡完整；COPD组支气管管腔狭窄，纤毛变性、脱落坏死，杯状细胞增多，间质内大量炎细胞浸润，气道及肺小动脉平滑肌增生肥厚，肺泡扩张，肺泡间隔狭窄断裂，相邻肺泡可见融合；氢分子干预组大鼠的气道上皮细胞脱落、纤毛的黏连、倒伏、杯状细胞增生、肺泡破坏和黏膜下层纤维组织增生等病理改变与COPD组大鼠对比明显较轻。

3.2 大鼠体质量

图2. 各组大鼠体质量的检测

烟熏前后，三组大鼠体质量皆有明显增长，烟熏后对照组大鼠体质量显著高于COPD组，氢分子干预组大于COPD组。

3.3 大鼠肺脏组织GSH

图3. 各组大鼠肺脏组织GSH的检测

COPD组肺组织GSH含量小于对照组且差异显著，氢分子干预组肺组织GSH含量大于COPD组，但仍小于对照组。

4.讨论

在本实验中，我们设置了对照组、COPD组和氢分子干预组，从大鼠的一般情况（体质量）、氧化应激标志物水平的改变和肺组织病理变化方面证实了氢分子对COPD大鼠的治疗作用。COPD组大鼠肺组织可见明显COPD相关病理改变，体质量增长情况不佳，肺组织中GSH水平下降；而相较于COPD组，氢分子干预组大鼠的肺脏组织病理变化更轻，体质量增长情况更好，肺组织中GSH水平下降程度较轻。GSH常被认为是机体抗氧化能力的重要指标，它能够结合并清除机体内的自由基，减少组织损伤，调控内外源性抗氧化剂的作用平衡[7]。氢分子干预组GSH水平相对COPD组高，表明经氢分子干预的大鼠肺组织内氧化应激水平降低，抗氧化能力提高。

COPD组与对照组相比，肯定了本研究采用LPS联合烟熏的方法成功构建了COPD动物模型，以及氧化应激过程在该病的病理生理过程中扮演了重要角色。在此基础上，COPD组与氢分子干预组则证明了氢分子改善了COPD大鼠的一般情况，减轻了肺脏组织损伤，提高了GSH含量，抗氧化能力提高，其具体机制有待进一步探究。

本课题需改进：外周血血清炎症标志物水平能够评估COPD病情的严重程度，而且对于预后情况诊断具有重要价值[8]，因此可进一步采集大鼠血清测定IL-6、IL-8等炎症标志物水平，更深入地判断氢分子对COPD大鼠的治疗效果；还可以设置与临床上常用药物的治疗对照组，如糖皮质激素组、抗胆碱药物组等，与氢分子干预组比较疗效，判断氢气治疗COPD的临床应用价值；实验未能深入到某一详细的信号通路及其下游分子研究氢气抗氧化损伤的详细分子调控机制，本课题组下一步将继续研究氢气干预改善COPD大鼠氧化损伤的分子机制，希望能为临床上COPD新的治疗方法的建立开辟新思路。

参考文献

[1]丁明静,徐桂华,高笑宇,等.慢性阻塞性肺疾病发病机制研究进展[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(22):118+123.

[2]李佳.慢性阻塞性肺疾病的临床治疗进展[J].中国医学创新,2015:150-152.[1]Shen

[3]Shen Meihua,Zhang Hongying,Yu Congjun,Wang Fan,Sun Xuejun. A review of experimental studies of hydrogen as a new therapeutic agent in emergency and critical care medicine.[J]. Medical gas research,2014,4(1).

[4]Matei Nathanael,Camara Richard,Zhang John H. Emerging mechanisms and novel applications of hydrogen gas therapy.[J]. Medical gas research,2018,8(3).

[5] Wang D ,  Wang L ,  Yu Z , et al. Hydrogen gas inhibits lung cancer progression through targeting SMC3[J]. Biomedicine & pharmacotherapy = Biomedecine & pharmacotherapie, 2018, 104:788-797..

[6]张宁 张景熙. 吸入高浓度氢气对大鼠支气管哮喘的治疗作用[J]. 国际呼吸杂志, 2015, 35(3):4.

[7]刘晓燕,戴爱国,胡瑞成,朱黎明,谭双香.慢性阻塞性肺疾病大鼠转录因子KLF2对Nrf2调控γ-GCS表达的影响[J].中国应用生理学杂志,2012,28(02):173-178+195.DOI:10.13459/j.cnki.cjap.2012.02.022.

[8]杨忠,王帅,郭亚威.外周血血清炎性指标对于评估慢性阻塞性肺疾病病情严重程度和预后的价值[J].黑龙江医药科学,2022,45(04):78-79+81.