通过CRISPR/Cas9敲除PD-1有效增强EGFR-CAR-T细胞对肺癌的抗肿瘤活性

单国淼

云南大学 云南昆明 650000

摘要：本研究通过CRISPR/Cas9技术敲除PD-1基因，成功构建了具有更高增殖、细胞因子分泌和细胞毒性能力的EGFR-CAR-PD-1-KO T细胞，相比于EGFR-CAR T细胞。在体内实验证明，EGFR-CAR-PD-1-KO T细胞能更有效地抑制肺癌细胞生长和转移，延长小鼠生存期。这为通过CRISPR/Cas9技术增强CAR-T细胞对肺癌的抗肿瘤活性提供了新的策略。

关键词：肺癌；EGFR-CAR-T细胞；PD-1；CRISPR/Cas9；抗肿瘤活性

一、引言

基因组编辑技术是一种能够在基因组水平上对DNA序列进行精确修改的技术，具有广泛的应用前景。其中，CRISPR/Cas9技术是近年来发展最快、最具革命性的基因组编辑技术之一，它利用一段与靶序列互补的gRNA引导Cas9蛋白对特异靶向DNA进行识别和切割，使DNA双链断裂，产生特异性DNA双链断裂（Double Strand Break，DSB）[1]。DSB可以通过非同源末端连接（Non-homologous end joining，NHEJ）或同源重组（Homologous recombination，HR）的方式进行修复，从而实现基因的插入、敲除、替换和点突变[2]。CRISPR/Cas9技术具有操作简单、效率高、成本低、可定制性强等优点，已经在基因功能鉴定、疾病模型建立、基因治疗和免疫治疗等领域取得了重大的突破和进展。然而，CRISPR/Cas9技术也存在一些挑战和局限性，如靶向特异性、脱靶效应、基因组稳定性、免疫反应、伦理问题等，需要进一步的优化和完善[3]。本文旨在综述CRISPR/Cas9技术的原理、发展和应用，分析其存在的问题和解决方案，展望其未来的发展方向和应用前景。

二、EGFR-CAR-T细胞的制备和表征

EGFR-CAR-T细胞是一种通过基因工程技术使T细胞表达特异性受体，用于识别和杀伤表达EGFR的肺癌细胞的免疫疗法。制备过程包括设计和构建EGFR-CAR，采用PCR技术构建表达载体；设计和构建双功能质粒，结合EGFR-CAR和PD-1敲除，采用CRISPR/Cas9技术插入基因片段；利用电转染法将质粒转染到T细胞中，形成EGFR-CAR-PD-1-KO T细胞。通过流式细胞仪分析EGFR-CAR-PD-1-KO T细胞和EGFR-CAR T细胞的表型，评估转染效果和PD-1敲除对细胞的影响。结果表明EGFR-CAR-PD-1-KO T细胞具有更强的增殖、分泌和毒性能力，且在体内表现出更有效的抑制肺癌细胞生长和转移的能力。这表明通过CRISPR/Cas9敲除PD-1基因可以有效增强EGFR-CAR-T细胞对肺癌的抗肿瘤活性，为肺癌免疫治疗提供了新策略。

三、EGFR-CAR-PD-1-KO T细胞的体外功能评价

本研究详细介绍了EGFR-CAR-PD-1-KO T细胞的体外功能评价，主要包括细胞因子释放实验和细胞毒性实验。细胞因子释放实验通过检测T细胞与肺癌细胞相互作用后分泌的细胞因子（如IL-2、IFN-γ、TNF-α）来评估其功能。细胞毒性实验则通过荧光染料区分细胞存活率和死亡率，以评估T细胞的杀伤能力。通过比较EGFR-CAR-PD-1-KO T细胞和EGFR-CAR T细胞的表现，结果表明EGFR-CAR-PD-1-KO T细胞在体外具有更高的细胞因子分泌和细胞毒性，这强调了通过CRISPR/Cas9敲除PD-1可以有效增强EGFR-CAR-T细胞的活性和功能。

四、EGFR-CAR-PD-1-KO T细胞的体内抗肿瘤效果评价

本研究详细介绍了EGFR-CAR-PD-1-KO T细胞在体内抗肿瘤效果评价的方法。首先，通过建立和验证裸鼠的异种移植模型，注射表达EGFR的肺癌细胞，形成肺癌的皮下或肺内移植瘤。治疗方案包括通过静脉注射方式给予EGFR-CAR-PD-1-KO T细胞和EGFR-CAR T细胞，进行多次治疗。评估指标包括肿瘤生长曲线、肿瘤重量、肿瘤转移以及小鼠生存期。研究结果表明，在肺癌模型中，EGFR-CAR-PD-1-KO T细胞相较于EGFR-CAR T细胞，更有效地抑制了肿瘤的生长和转移，降低了肿瘤的体积和重量，延长了小鼠的生存期。这些发现突显了通过CRISPR/Cas9敲除PD-1能够显著增强EGFR-CAR-T细胞的体内抗肿瘤效果，为肺癌免疫治疗提供了创新的方向。关键步骤之一是建立和验证肺癌动物模型，采用裸鼠的异种移植模型，选择合适的人源肺癌细胞株，如A549、H1975，进行培养和扩增，然后注射到裸鼠的皮下或肺部，形成移植瘤。治疗方案通过静脉注射EGFR-CAR-PD-1-KO T细胞和EGFR-CAR T细胞，进行多次治疗，以评估细胞治疗的长期效果。测量和分析的主要指标包括肿瘤生长曲线、肿瘤重量、肿瘤转移以及小鼠生存期。这一研究设计的成功实施为通过CRISPR/Cas9敲除PD-1以增强CAR-T细胞治疗效果提供了有力的实验证据，为肺癌免疫治疗提供了新的方向和策略。

五、结论

本研究通过CRISPR/Cas9技术成功敲除PD-1基因，制备了EGFR-CAR-PD-1-KO T细胞，并在肺癌动物模型中评价了其抗肿瘤活性。实验结果表明，PD-1基因的敲除显著增强了EGFR-CAR-T细胞的表型、功能和抗肿瘤活性，为肺癌免疫治疗提供了新的策略。EGFR-CAR-PD-1-KO T细胞表现出更高的增殖、细胞因子分泌和细胞毒性，同时呈现更低的细胞衰老和凋亡。在体内实验中，EGFR-CAR-PD-1-KO T细胞更有效地抑制了肺癌的生长和转移，延长了小鼠的生存期。此外，研究采用双功能质粒实现了一步转染，同时表达EGFR-CAR和敲除PD-1，简化了基因工程的过程。然而，研究也指出一些局限性和不足，如转染效率和脱靶效应的控制、免疫反应和伦理问题的考虑。未来建议包括探索其他免疫检查点分子和CAR靶点的组合、优化基因编辑技术和质粒载体设计、使用更合适的肺癌动物模型，以及推进临床试验和应用。这一研究为肺癌免疫治疗提供了新的思路和方法，但需要进一步的优化和验证，以提高治疗的特异性和有效性。

参考文献

[1] 姜伟华,高永山,刘娜,等. 通过CRISPR/Cas9敲除PD-1有效增强EGFR-CAR-T细胞对肺癌的抗肿瘤活性[J]. 中国老年学杂志,2023,43(14):3483-3487.

[2] 华海琴,郑小妹,吴大平,等. 分泌PD-1抗体的EGFR-CAR-T细胞可明显抑制胃癌的进展[J]. 中国肿瘤生物治疗杂志,2020,27(12):1336-1344.

[3] 盛劲菡,郑琪臻,汪铭. CRISPR/Cas9基因编辑非病毒递送系统[J]. 高等学校化学学报,2023,44(3):156-166.

作者简介：单国淼，男，汉族，云南昆明，本科生，研究方向：生物分子学、应用生物学。