槲皮苷对APP/PS1转基因小鼠学习记忆能力及脑组织AchE,Aβ,MAP和BDNF表达的影响

薛小燕

赣州市人民医院                 药剂科         江西赣州  341000

课题名称：江西省卫生健康委科技计划项目，立项编号：202212518

【摘要】目的：探讨槲皮苷对APPPS1转基因小鼠学习记忆能力及脑组织AchE,Aβ,MAP和BDNF表达的影响。方法：4月龄APP/PS1双转基因小鼠100只，雄性，同时选择相同月龄转基因阴性小鼠20只(雄性)，购自实验动物科学中心。将APP/PS1双转基因小鼠随机分为5组，每组20只：模型组、槲皮苷低剂量组、槲皮苷中剂量组、槲皮苷高剂量组、阳性药（多奈哌齐）对照组，转基因阴性小鼠为正常对照组。比较各组小鼠学习记忆能力及脑组织相关指标水平。结果：（1）槲皮苷组（低、中、高）入水逃避潜伏期、游泳速度及穿越平台次数均分别优于模型组（P均＜0.05），且结果与正常对照组相接近（P均＞0.05）；（2）槲皮苷组（低、中、高）Aβ, AchE, MAP-2, BDNF均分别优于模型组（P均＜0.05），且结果与正常对照组相接近（P均＞0.05）。结论：槲皮苷能够有效改善APP/PS1转基因小鼠学习记忆能力，其作用机制可能与增加脑组织AchE, BDNF及MAP，降低Aβ相关，但需进一步进行研究。

【关键词】槲皮苷；APP/PS1转基因小鼠；学习记忆能力；AchE；MAP；BDNF

0引言

阿尔兹海默症(Alzheimer’SDisease，AD)是一种与年龄相关的渐进性神经退行性疾病，是引起老年人痴呆的最常见原因，目前无特效药治疗，因此亟待寻找新的经济有效的防治策略。槲皮苷是一种天然的黄酮类化合物，人群、动物和细胞实验均提示其具有神经保护作用。近期多项针对Aβ途径的Ⅲ期临床试验均告失败，如靶向Aβ的单克隆抗体bapineuzumab等，尽管可以轻微降低Aβ聚集，但不能显著改善AD患者的认知障碍。这些失败的临床试验提示，病情太过晚期，靶点不够准确等，可能是失败的原因。鉴于AD致病因素的多样性

，阻断单途径单靶点不能明显的减少神经元全面的功能障碍和损失，利用中药多途径、多靶点的优势治疗AD，对改善AD患者的症状，调理脑功能，起到很好的治疗作用。近年研究表明，槲皮苷具有抗炎症，抗氧化、抗凋亡等功效，对早期AD的防治具有积极意义。我们前期体外研究已证实槲皮苷通过激活下游的PI3K/Akt信号转导通路发挥神经营养作用。因此，本课题结合前期研究成果，通过构建APP/PS1转基因小鼠，探讨槲皮苷对APP/PS1转基因小鼠学习记忆能力及脑组织AchE, Aβ, MAP和BDNF表达的影响，明确槲皮苷多靶向治疗AD的体内疗效，并明确其作用机制，为槲皮苷治疗AD提供实验依据，为开发治疗AD的多靶标药物提供新的思路。现报道如下：

1研究对象及方法

1.1研究对象      4月龄APP/PS1双转基因小鼠100只，雄性，同时选择相同月龄转基因阴性小鼠20只(雄性)，购自实验动物科学中心。将APP/PS1双转基因小鼠随机分为5组，每组20只：模型组、槲皮苷低剂量组、槲皮苷中剂量组、槲皮苷高剂量组、阳性药（多奈哌齐）对照组，转基因阴性小鼠为正常对照组。根据前期预实验结果，从10月龄开始，给予小鼠每天灌胃给药，每24h给药一次。给药8周后开始行为学测试。

1.2 主要检测指标

① Morris水迷宫行为学检测（学习记忆能力测试）：水迷宫适应性训练、定位航行试验、空间探索实验等测试。

② 胆碱能相关指标：脑内AchE的活性：将分离的脑组织加入预冷的生理盐水，超声裂解，离心15 min，吸取上清至试管中储存于-20℃备用。分别按AchE测定试剂盒说明操作。

③ ELISA检测脑中 Aβ1-40 和 Aβ1-42 的水平：将分离的脑组织加入预冷的生理盐水，超声裂解，离心15 min，吸取上清至试管中储存于-20℃备用。分别按 Aβ1-40和Aβ1-42 ELISA 试剂盒说明操作。

④ RT-PCR检测脑中MAP2的水平：将分离的脑组织加入预冷的生理盐水，超声裂解，离心15 min，吸取上清至试管中储存于-20℃备用。提取总RNA，按 RT-PCR试剂盒说明操作。

⑤ RT-PCR检测脑中BDNF的水平：将分离的脑组织加入预冷的生理盐水，超声裂解，离心15 min，吸取上清至试管中储存于-20℃备用。提取总RNA，按 RT-PCR试剂盒说明操作。

1.3 统计学方法      采用SPSS22.0软件对数据进行统计分析。

2 结果

2.1 各组小鼠学习记忆能力对比      槲皮苷组（低、中、高）入水逃避潜伏期、游泳速度及穿越平台次数均分别优于模型组（P均＜0.05），且结果与正常对照组相接近（P均＞0.05），见表1。

表1 各组小鼠学习记忆能力（x±s）

组别	入水逃避潜伏期（s）	游泳速度（cm/s）	穿越平台次数（s）
正常对照组（n=20）	29.56±2.51	126.04±11.87	6.03±1.35
模型组（n=20）	50.89±5.12①	102.45±11.03①	3.45±0.98①
阳性药（多奈哌齐）对照组（n=20）	32.34±3.92②	120.11±11.25②	5.68±1.12②
槲皮苷低剂量组（n=20）	34.11±3.37②	119.03±10.98②	5.63±1.29②
槲皮苷中剂量组（n=20）	33.25±3.32②	121.67±11.32②	5.68±1.25②
槲皮苷高剂量组（n=20）	34.91±2.96②	122.00±12.77②	5.75±1.31②

注意：①②，分别表示与正常对照组、模型组比较，P＜0.05.

2.2 各组小鼠相关基础指标水平对比      槲皮苷组（低、中、高）Aβ、AchE、MAP-2、BDNF均分别优于模型组（P均＜0.05），且结果与正常对照组相接近（P均＞0.05），见表2。

表2 各组小鼠相关基础指标比较（x±s）

组别	Aβ（pg/mL）	AchE（U/mgprot）	MAP-2（pg/mL）	BDNF（pg/mL）
正常对照组（n=20）	0.79±0.21	123.09±13.44	0.35±0.0.15	511.21±55.98
模型组（n=20）	2.90±0.41①	68.02±10.25①	0.16±0.06①	340.20±32.77①
阳性药（多奈哌齐）对照组（n=20）	1.10±0.24②	110.01±11.25②	0.27±0.09②	490.02±39.23②
槲皮苷低剂量组（n=20）	1.05±0.20②	108.22±10.95②	0.26±0.14②	468.89±53.46②
槲皮苷中剂量组（n=20）	1.00±0.21②	109.39±12.23②	0.27±0.09②	481.23±52.22②
槲皮苷高剂量组（n=20）	1.06±0.16②	109.60±14.22②	0.28±0.16②	485.77±53.33②

注意：①②，分别表示与正常对照组、模型组比较，P＜0.05.

3 讨论

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是最常见的痴呆类型，以不可逆的进行性记忆和认知功能障碍，最终导 致生活能力的丧失为特征。根据2019年国际AD协会的报告，2019年估计全球有超过5000万人患有AD，到2050年 ，这一数字将增加到1.52亿。截至2019年，中国有1000多万AD患者，预计2050年中国将有2800万患者，中国拥有 世界最大AD 群体，并且这个群体还在急速扩大[1]。

在过去的近20年间，胆碱酯酶抑制剂一直是治疗AD的首选药物 [2-4]，包括他克林（Tacrine）、多奈派齐[Donepezil，商品名：安里申（Aricept）]、重酒石酸卡巴拉汀[Rivastigmin，商品名：艾斯能（Exelon）]、毒扁 豆碱（Physostigmin，商品名：synapton）、美曲膦酯（Metrifonate）、石杉碱甲（huperzine A，商品名：双益 平）等。神经营养药、抗自由基药、促智药、钙拮抗药、抗炎药、降血脂药等也在临床用于治疗AD。正在研制的AD治疗药物还有Aβ生成抑制剂、SP清除剂、AD疫苗等。但总的看来，以上药物对早期AD尚有一定疗效，可延 缓AD进程；对中期AD部分有效，可控制AD部分症状；对晚期AD，基本无效。AD是多因素的复杂疾病，目前临 床上较难治愈，迄今为止被批准的只有AchE抑制剂和美金刚，但均只治标不治本。随着人们对AD研究的深入 ，治疗和预防该病的新方法、新药物不断涌现，并且更加注重针对AD病因药物的研究，如抗Aβ药物就是研究治 疗AD药物的一个主要方向 [5]，但近期多项针对Aβ途径的Ⅲ期临床试验均告失败，如靶向Aβ的单克隆抗体bapineuzumab等，尽管可以轻微降低Aβ聚集，但不能显著改善AD患者的认知障碍。这些失败的临床试验提示 ，病情太过晚期，靶点不够准确等，可能是失败的原因 [6-9]。鉴于AD病理和生理的复杂性，单纯依靠某单一靶 向药物只能在一定时间和范围内取得一定效果，要有效控制疾病症状和病程的发展，必须采用多靶位点的综合治 疗法。因此，AD的多靶向药物治疗应运而生，并被给予厚望。

综上所述，槲皮苷能够有效改善APP/PS1转基因小鼠学习记忆能力，其作用机制可能与增加脑组织AchE、BDNF及MAP，降低Aβ相关，但需进一步进行研究。

参考文献：

[1] Bayen E, Possin KL, Chen Y, Cleret de Langavant L, Yaffe K: Prevalence of Aging, Dementia, and Multimorbidity in Older Adults With Down Syndrome. JAMA Neurol 2018, 75: 1399-1406.

[2] Winslow BT, Onysko MK, Stob CM, et al. Treatment of Alzheimer disease[J]. Am Fam Physician, 2011, 83: 1403-1412.

[3] Aisen PS, Cummings J, Schneider LS. Symptomatic and nonamyloid/tau based pharmacologic treatment for Alzheimer disease[J]. Cold Spring Harb Perspect Med, 2012, 2: a006395.

[4] Olivares D, Deshpande VK, Shi Y, et al. N-Methyl D-Aspartate (NMDA) Receptor Antagonists and Memantine Treatment for Alzheimer's Disease, Vascular Dementia and Parkinson's Disease[J]. Curr Alzheimer Res, 2011.

[5] Salloway S, Sperling R, Gilman S, et al. A phase 2 multiple ascending dose trial of bapineuzumab in mild to moderate Alzheimer disease[J]. Neurology, 2009, 73: 2061-2070.

[6] Schott J M, Aisen PS, Cummings JL, et al. Unsuccessful trials of therapies for Alzheimer's disease[J]. Lancet, 2019, 393(10166).

[7] Anita S. Aβ-Clearing Drug Fails to Slow Alzheimer Disease[J]. Jama, 2018, 319(24): 2470-2476.

[8] Linnarsson S, Bjorklund A, Ernfors P. Learning deficit in BDNF mutant mice.EurJ Neurosci, 1997, 9(12): 2581-2587.

[9] 李熙. p38MAPK信号通路在逆灸防治阿尔茨海默病模型大鼠中的作用研究. [硕士学位论文]. 武汉：湖北中医药大学, 2012.课题名称：江西省卫生健康委科技计划项目，立项编号：202212518