泛素结合酶-9(Ubc9)对胃癌细胞凋亡的影响研究

袁金华 曾宪晶

（井冈山大学附属医院，全科医学科 江西吉安  343000）

摘要：目的：探究泛素结合酶-9对胃癌细胞凋亡的影响。方法:采用Ubc9基因的质粒对胃癌SGC7901细胞株进行瞬时转染，将实验对象分为：正常胃癌细胞A组(Normal组)，脂质体B组(Lipo-2000组)，空载质粒C组(NC-shRNA组)，及目的质粒D组(Ubc9-shRNA组)。采用qRT-PCR检测各组mRNA水平，Western-blot检测各组Ubc9、α-SMA、Bcl-2蛋白表达结果，流式细胞仪检测各组细胞周期与凋亡结果。结果：1.与各组比较，Ubc9-shRNA组转染后细胞凋亡增加（P < 0.05）；2.Ubc9-shRNA组能显著的抑制胃癌SGC7901中Ubc9基因的表达（P < 0.05）；3.Ubc9-shRNA组明显抑制SGC7901细胞中Ubc9、α-SMA、Bcl-2蛋白表达（P < 0.05）。结论：Ubc9能抑制SGC7901细胞的增殖，诱导胃癌细胞凋亡。

关键词：胃癌；泛素结合酶-9；细胞凋亡

基金项目：江西省卫健委科技计划（SKJP220229855），吉安市科技计划项目（2022-026796）

作者简介：袁金华，男，主治医师，主要从事肿瘤临床诊疗工作。

胃癌是消化道常见的恶性肿瘤，根据全球癌症研究机构的数据统计，胃癌位于全球恶性肿瘤发病的第五位，死亡率位于第三位。我国是胃癌的高发区，发病率和死亡率分别占到全球的42.6%和45.0%[1]，且发病呈年轻化趋势。当前胃癌治疗方法主要是手术、放疗和化疗，但预后较差，寻找有效的治疗手段对本病的治疗具有重要意义。研究表明：泛素结合酶9 (Ubc9) 是小泛素相关修饰物（SUMO）过程中唯一的结合酶，Ubc9在细胞增殖、有丝分裂、周期进程、分化等方面发挥着重要作用[2]，Ubc9作为一个促癌基因，参与了肿瘤发生和进展的病理过程，抑制Ubc9基因，可能诱导胃癌细胞的凋亡。本研究针对Ubc9诱导胃癌SGC7901细胞凋亡的影响展开分析，为临床提供理论支持。

1材料与方法

1.1 主要实验材料

胃癌SGC7901细胞株(上海赛默生物有限公司)，兔抗Ubc9单克隆抗体、兔抗p65单克隆抗体、兔抗IKBα单克隆抗体、兔抗Bcl-2单克隆抗体、山羊抗小鼠β-actin(美国 Abcam 公司)，Trizol Reagent（Invitrogen公司），胎牛血清（上海碧云天生物技术有限公司），RPIM-1640培养基(Hyclone公司)，Ubc9引物(Generay Biotech公司)。

1.2细胞培养转染

SGC79013细胞复苏后培养于含10%胎牛血清的RPIM-1640培养基中，于5%CO2、37℃培养箱中传代培养，每3～4 d按照1∶3比例传代1次，取对数生长期细胞进行相关实验。按5×104/ml的细胞密度接种至六孔板中后放入恒温培养箱中继续培养。将实验细胞分为四组：正常胃癌细胞A组(Normal组)，脂质体B组(Lipo-2000组)，空载质粒C组(NC-shRNA组)，及目的质粒D组(Ubc9-shRNA组)。

细胞转染：准备5个1.5m1的EP管，分别向每管内加入0. 5ml Opti-DMEM，其中2个EP管做好标记分别加入l0ug空载质粒及目的质粒，余3管加入20ul的lipo2000，混合后静置。接着向加入lipo2000的3个EP管分别加入目的质粒、空载质粒以及500ul Opti-DMEM，混匀，最后将配置好的各EP管内液体分别加入所对应的培养皿中，置入培养箱中培养。

1.3 qRT-PCR检测基因表达

细胞转染48h后，使用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，并反转录得到cDNA，以此为模板进行qRT-PCR目的基因扩增，结果计算根据LC 480检测得出的CT值为cDNA荧光强度达到所设定阂值的循环数，ΔCt=目的基因CT值-内参基因CT值，每个样品中mRNA相对表达量=2-ΔCT× 100%。

1.4 Western-blot检测蛋白表达

采用蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，BCA法测定总蛋白浓度，

上样SDS-PAGE胶，电泳，转膜、封闭，抗体孵育，显影成相，利用凝胶图像处理系统分析目标条带灰度值，记录其相对表达量。

1.5流式细胞仪检测细胞周期与凋亡

细胞周期检测：调整细胞浓度为1×106个/ml，离心，重悬后收集细胞，采用1ml已配制好的周期试剂检测各组细胞的周期，按照试剂盒说明书进行反应后，30 min内进行流式细胞仪检测细胞的周期。

2实验结果

2.1各组Ubc9基因mRNA的表达水平

与各组比较，D组能显著的抑制胃癌SGC7901中Ubc9基因的表达（P < 0.05）表1。

表1各组Ubc9基因mRNA表达水平

组别	A	B	C	D
Ubc9	0.76±0.06	0.75±0.08	0.78±0.06	0.31±0.06

2.2 各组Ubc9与α-SMA，Bcl-2蛋白表达水平

与各组相比，D组明显抑制了SGC7901中Ubc9，α-SMA，Bcl-2蛋白的表达，差异具有统计学意义（P < 0.05）表2。

表2 各组蛋白表达水平

组别	A	B	C	D
Ubc9	0.62±0.02	0.63±0.01	0.67±0.01	0.28±0.01
α-SMA	0.77±0.03	0.78±0.05	0.81±0.2	0.24±0.02
Bcl-2	0.87±0.04	0.70±0.02	0.74±0.01	0.58±0.01

2.3细胞周期结果

转染后胃癌SGC7901细胞的周期被阻滞在G2/M期，并且能够促进SGC7901的凋亡，与各对照组相比差异具有统计学意义（P < 0.05）表3。

表3各组细胞周期结果

组别	G1（%）	S（%）	G2（%）
A	52.7±2.4	38.9±2.0	8.2±1.9
B	55.8±2.5	37.0±1.2	7.1±1.1
C	52.1±1.1	39.9±1.2	7.9±1.2
D	45.2±1.8	34.3±1.4	20.4±2.2

2.4细胞凋亡结果

D组转染后SGC7901细胞的凋亡增加明显，与各对照组相比差异具有统计学意义（P < 0.05）表4。

表4各组细胞凋亡结果

组别	凋亡率（%）
A	11.3±0.3
B	11.0±0.4
C	11.2±0.5
D	29.7±0.4

3讨论

胃癌是临床上最常见的消化道恶性肿瘤，发病率呈逐年上升趋势，大多数患者就诊时已进入中晚期，临床治疗效果不佳，诱导肿瘤细胞凋亡是抗癌药物治疗肿瘤的重要机制之一。研究表明：泛素样小分子修饰SUMO参与了多种细胞进程，如细胞周期的调控、细胞增殖、细胞凋亡及DNA损伤修复等[3]。

细胞凋亡一种程序性的细胞死亡，Bcl-2基因主要的生理功能是减少细胞凋亡，研究发现Bcl-2基因在多种恶性肿瘤组织中高表达[4]。研究证实凋亡是由于caspases家族蛋白的瀑布式反应而导致的细胞自身溶解的过程，Bcl-2蛋白不仅能抑制细胞凋亡，亦可能拮抗抑癌基因所介导的细胞凋亡[5]。作为抗凋亡蛋白，Bcl-2蛋白能够通过抑制肿瘤凋亡来促进其扩散。转录激活后入核的NF-κB可调控下游凋亡相关基因Bcl-2、Bax及细胞增殖相关基因Cyclin D1的转录，从而发挥对细胞增殖、分化、凋亡及细胞周期的调控[6]。在本次实验中，我们观察发现Ubc9转染后胃癌SGC7901细胞的周期被阻滞在G2/M期，并且细胞的凋亡增加明显，Bcl-2水平降低，与各对照组相比，差异具有统计学意义（P < 0.05），提示Ubc9可能是通过影响Bcl-2基因的表达来调控胃癌SGC7901细胞的凋亡，Mo等[7]下调Ubc9后乳腺癌MCF-7细胞生长受抑制，凋亡增加，Ubc9是通过Bcl-2发挥作用，结果表明Ubc9通过影响Bcl-2基因表达而具有抗凋亡作用。

综上所述，人工合成的针对Ubc9基因的miRNA质粒能够抑制SGC7901细胞的增殖及促进其凋亡，对胃癌的治疗具有一定的潜在作用，为胃癌的治疗提供了一种新的实验依据。

参考文献

[1]王林俊.早期胃癌保功能手术的治疗进展[J/OL].中国普外基础与临床杂志:1-6

[2]赵天豪,.泛素结合酶2S在胃癌中的表达及临床意义[J].中华全科医学,2023,21(04):555-559

[3]麦蕾,赖人旭.结直肠癌组织泛素样小分子修饰因子-1表达及其临床意义[J].中华肿瘤防治杂志,2015,22(02):113-115

[4]朱蕾,陈蕾.BCL-2、Bax及Beclin-1表达与非小细胞肺癌临床病理特征的相关性分析[J].保健医学研究与实践,2023,20(04):49-54.

[5]徐瑞宇. BCL-2家族在恶性肿瘤治疗的研究进展(2)[C]//中国抗癌协会肿瘤标志专业委员会,2023:1

[6]谢燕华.黄芩苷诱导人肝癌HepG-2细胞凋亡及对Bcl-2和Bax蛋白表达的影响[J].陕西中医药大学学报,2023,46(05):78-82.

[7]Mo YY, Moschos SJ.Targeting Ubc9 for Cancer Therapy[J].Expert Opin Ther Targets, 2005, 9 (6) :1203-16.