酿酒酵母工程菌株的构建与发酵优化措施

陈世权

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摘要：啤酒酵母是一种与人类生活息息相关的微生物，也被称为“发酵酵母”或“发酵酵母”。它是一种重要的啤酒发酵菌种；它是葡萄酒质量的灵魂，对葡萄酒的色泽、香味和口感有很大的影响。酿酒酵母是一种安全、快速繁殖和快速代谢的酵母菌；它的生产过程可以很好地控制，并且可以很方便地进行大规模的培养，而且它的来源非常广泛，可以被广泛地应用到酿造、医药、饲料工业等多个领域。通过对发酵培养条件进行优化，可以让酵母细胞密度得到提升，从而可以提升生产效率，降低生产成本。这为以后的大规模培养，使它能够更好地发挥出它在食品发酵工业中的作用，提供了理论依据，奠定了实践基础。

关键词：酿酒酵母；酵母工程；菌株构建；发酵优化

引言

酿酒酵母由于其生长速度快，对糖的转化效率高，因此，它是发酵生产燃料乙醇的最重要的微生物。然而，由于酿酒酵母对高浓度酒精十分敏感，其在工业发酵系统中的酒精浓度一般在14%以下，导致了其高浓度酒精的生产成本，从而限制了其商业化应用。在此基础上，本项目拟通过对前期对酿酒酵母乙醇耐受性、高温耐受性、高渗性等方面的研究，全面解析酿酒酵母不同类型逆境下的耐受性提升技术，为实现高容积率酒精发酵的产业化应用奠定基础。

一、资料和方法

（一）菌株

从浓香型白酒窖池中筛选出的一株酿酒酵母Y013。

（二）培养基

筛选菌种的培养基：5.0克/升、10.0克/升、1.0克/升、0.5克/升（无水）、0克/升琼脂、0.0333克/升的孟加拉国红、0.1克/升的氯霉素、1000毫升的蒸馏水、121度的天然 pH值、20分钟的杀菌。

倾斜式培养基：20.0克/升、10.0克/升、5.0克/升、14.0克/升琼脂、1000毫升蒸馏水、天然 pH值、121℃杀菌20分钟。

发酵培养基：一份高粱粉，和四份水一起蒸煮0.5~1小时，按照淀粉酶的使用说明，将淀粉酶添加到其中，然后进行液化。在液化之后，再添加一份55~75℃的温水，将其搅拌均匀，在55~75℃下糖化0.5~1小时，用稀碘液测试，不会出现蓝色，用细纱布过滤，对溶液的糖度进行测量，并将其调节为8~10°波美度，自然 pH值,115℃消毒20分钟后才能使用。

（三）研究方法

使用10倍稀释法，用无菌生理盐水将采集的样品（制曲原料、大曲以及窖泥等）稀释至10-5、10-6、10-7，分别吸取1 mL稀释液转入无菌培养基中，用涂布棒涂抹均匀，在28℃下培养48 h，待培养基表面长出单个菌落。以菌落的大小、颜色、透明度为依据，筛选出了具有酿酒酵母菌典型菌落特点的单个菌落，用接种针挑取单个菌落，在平板上划线分离，划线分离三次后，用显微镜对其进行观察，选出纯的菌落，之后将其接种在试管斜面培养基上，28℃条件下培养48小时后，将其放在4℃保存备用。向样品瓶中加入35~40 mL种子培养基，放入磁力搅拌子，盖上带透气膜和密封圈的上盖，灭菌冷却后，在生物安全柜中以5%的接种量插入二级种子液。将样本瓶按编号放置在计算机的对应位置，在计算机的显示屏上或者在计算机的控制软件上设定一些参数，如样本的培养温度，搅拌速度，检测间隔时间等；当主机的温度在设定值的±2℃左右时，按下启动测试键，并将测试结果记录下来。样本分析完毕后，从“打开文件”中获取相应的数据，并按要求将各样本的数据组合，对比分析，得出相应的图表。

二、研究结果及探讨

在此基础上，采用单因子实验法，确定了发酵温度、发酵时间、转子转速等主要因子对发酵过程的影响。在工业发酵过程中，啤酒酵母菌的生长与代谢过程都离不开培养基。因此，如何设计与优化发酵介质是影响发酵效果的关键因素。通过对原始培养基组成进行配比，并采用不同的试验设计方法，实现了酿酒酵母对不同胁迫因素的耐受性的增加，进而达到了发酵产物的提高。结果表明，在26~30℃的条件下，啤酒酵母菌的最大细胞密度随温度的增加；结果表明，在30~34℃的条件下，啤酒酵母菌的最高细胞密度随温度的上升而下降。结果表明，在30℃条件下，啤酒酵母菌的最大细胞密度最大；在旋转速度为50-150 r/min的情况下，随旋转速度的增加，最高细胞密度增大；在150~250℃范围内，随转子速度的增加，最高细胞密度呈下降趋势。其中，在150℃的转子速度下，啤酒酵母菌的细胞密度达到了最高值。细胞膜作为一道天然的屏障，将细胞内外的物质隔离开来，导致细胞内重要的物质如蛋白、核酸等外溢，从而影响细胞的正常功能。

为此，近几年，对非酿酒酵母进行了可控制的利用，并将其与酿酒酵母同步接种混合发酵和顺序接种混合发酵相结合，将其在色泽、香气、口感和安全健康等方面的优势与酿酒酵母的强发酵和耐高温特性相结合，从而生产出具有产区特色的优质葡萄酒。燃料酒精是一种可以取代化石能源的燃料，是一种绿色的发展方式，也是一种符合国家安全需求的能源；对农林废弃物进行综合利用，有利于“三农”问题的解决。近几年，中国燃料乙醇行业的发展已经有了很大的进展，但与美国和巴西等发达国家相比，仍然存在着原料供应不稳定，产业链不完善，缺乏一个公平的竞争平台等问题，这给其发展带来了很大的障碍。无论是从技术发展还是从生产经营上来说，其核心问题就是发酵过程中所涉及的问题。在技术上，主要是通过提高发酵温度来降低凝结水的用量；目前，酒精发酵行业在降低成本和提高效率方面，更多地侧重于菌种的耐受改造。在此基础上，本项目拟开展以下几个方面的研究：（1）深入理解酿酒酵母对环境胁迫的响应机理；（2）过表达特定基因提高其对环境胁迫的特异耐受性；（3）优化培养基中的营养成分；（4）引入重组质粒，构建高抗环境胁迫的酵母菌株。随着科学技术的发展，对酵母耐受性能的研究技术将会得到持续的突破，将会出现更多优异的品种，并在工业生产中实现规模化应用，具有非常好的发展前景。

三、酵母的耐受性机理

作为一种重要的环境因子，温度不仅会影响酵母的酶活性，还会影响其对养分的吸收与利用，然而，不同的酵母菌种对酒精的耐受性也存在着差异。酒精是酿酒酵母最重要的代谢物，它是一种高度耐酒精的微生物，但对酒精的毒害也十分敏感。酒精含量随发酵时间的增加，并进一步抑制了酵母的生长。酵母能够通过对其代谢进行调控以确保其正常生长，这就是对酒精的耐受性。酒精诱导热休克蛋白（HSP）在酒精刺激下可产生特异的热激蛋白，该蛋白具有稳定细胞膜及蛋白的功能，可降低酒精的毒性，进而增强酒精的耐受性。当酒精含量增加，这两个基因就会被活化，产生与酒精含量有关的蛋白质及海藻糖，从而提高酵母的酒精耐受性；其中，海藻糖、脯氨酸具有防止蛋白质变性，降低膜通透性变化的作用。脯氨酸作为一种抗逆境胁迫的渗透性保护剂，能够在逆境中保持生物大分子的稳定。

结语

总之，在微酸的环境中，在缺氧的情况下，酿酒酵母能够通过自身的酶类将单糖分解成二氧化碳，从而产生乙醇。目前，酿酒酵母多以干酵母为主，由于其在极端条件下的抗逆性不如酿酒酵母，所以，研究其抗逆能力是一个亟待解决的科学问题。在此基础上，探索高产酵力酿酒酵母的最优培养条件，为其在啤酒酿造中的应用提供理论依据和技术支持。

参考文献

[1]霍春红,李鸿宇,李倩等.产虫草素酿酒酵母工程菌株的构建与发酵优化[J].生物工程学报,2021,37(09):3334-3347.

[2]霍春红. 产虫草素酿酒酵母工程菌株的构建与优化[D].大连工业大学,2021.

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