侧柏叶标准汤剂制备及质量标准研究

余丹

成都中医药大学附属医院药剂科 610072

摘要：目的：根据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》，对15批次的侧柏叶片进行煎液对照，构建药材性状指纹图谱，并对药材中槲皮素进行检测，为准确、准确地评定药材的品质奠定基础。方法：以槲皮素为指示组分，对15批次不同地区的侧柏叶片药材进行质量分析，并通过 HPLC鉴定其色谱指纹图谱。结果：15批次的侧柏叶片提取液提取率在10.51%—20.35%之间，平均含量16.08%；栎皮甙的含量在0.69%—1.12%之间，平均水平在0.91%之间；栎皮甙的转移率在51.11%~67.16%之间，平均数在57.67%之间；中药指纹图谱显示13个指纹图谱，鉴定出10个共有峰，与对照组比较，各指纹图谱的相似性都在0.90以上。结论：采用本方法制作的中药侧柏叶水煎液中槲皮素的含量及指纹图谱方法是可靠的，具有较高的准确性和重现性，既能作为中药复方制剂的有效成分，又能用于中药制剂的品质评定。

关键词：侧柏叶标准汤剂；槲皮苷；含量测定；HPLC；

侧柏是一种古老的中药材，其化学成分包括挥发油、黄酮类、单宁等。前期研究表明：侧柏叶具有止血、抗炎、抑菌、抗癌、防脱发及生长等多种功效；柏子仁具有安神定心、益智、延年益寿等功效。

一、仪器和试剂

1.器械。高效液相色谱仪（LG20AT-PDA)；1/100000磅（美国 SARTORIUS公司生产的 BT 25 S)；万份秤（SARTORIUS公司生产的BS124)；三孔加热式温控水箱（DK-80型号）；数字控制式超声清洗机（KQ500DE)；UPLC （1290）与四段杆-串联式质谱联用仪（6530,Q-TOF-MS）相连。

2.药物试验。乙腈（德国默克，色谱等级）、冰醋酸（北京化学工业公司，分析用）、甲醇（北京化学工业公司，分析用）、磷酸二氢钾（西陇化学公司，分析用）、水（娃哈哈纯水）（用标准）。

3. 标准品。槲皮苷对照品（批号：111538-201606，纯度：90.6%）、异槲皮苷对照品（批号：111809-201804，纯度：97.2%）、柠檬酸对照品（批号：111679-201602，纯度：97. o%）、苯丙氨酸对照品（批号：140676—201706，纯度：100.0%）、原儿茶酸对照品（批号：110809-201906，纯度：97.7%）、杨梅苷对照品（批次号：121396-201402)，对照品（批次号：111860-201703，纯度：95.2%）。

二、研究方法和成果

1. 规范汤剂的制作方法。将侧柏叶炮制品100 g分两次分两次，一次加入12倍水量，首先将其泡30分钟，然后用小火加热直到煮沸，小火慢炖30分钟，然后用300目筛子过滤；第二次，加入10份清水，小火慢炖20分钟，以300目的筛分滤，将两次煎出的药液混合，在减压下进行浓缩，得到一种液体提取物（生药的浓度大约是1克∶2毫升），然后进行冻干。

2.指数组分的确定。(1)层析条件及体系适应性实验采用 Wa tthsSymmetryC18柱（4.6mm X 250mm,5.0μm)；移动相为：（A）甲醇-01摩尔/升磷酸二氢钾（B)-冰醋酸，以40'60:1.5的洗脱比率；设定波长为254毫微米。(2) 供试品溶液的配制精确称取槲皮素标准品11.18 rag （批次：111538-201606、纯度90.6%)，置于25 mL容量瓶内，加入甲醇，经超声波作用，使之溶解，移除，冷却，用甲醇稀释，定容至刻度，均匀即得栎皮甙标准品贮备液，其含量为405.2 ug/mL；再次精确称取1 mL的对照品贮备液于10 ml容量瓶内，用甲醇进行稀释，得到40 52μ g/ml的供试品溶液。(3) 试验样品的配制精确地称量出柏木干燥粉末0.2克左右，置于有塞的圆锥瓶中，精确加入50毫升的甲醇，密闭称量，然后进行超声波（功率500瓦，频率40 kHz)30分钟，冷却后再次称量，用对应的溶剂补充减失量，使样品均匀，用0.45μm的微孔滤膜过滤，得到样品。

3.方法学研究。(1)峰的纯度检验：将所述对照品和所述被试溶液分别抽取，然后以 PDA 探测器在190nm-400nm范围内进行全波长处的扫描，得到的结果为0.999999，其最小峰位为0.999999，与对照品的分离结果一致，表明栎皮甙的色谱峰的纯度达到了规定的标准。(2)控制品的线性关系确定将制备的浓度为40.52 ug/mL、405.2 ug/mL的栎皮苷对照品溶液，然后精密汲取2 uL、5 uL、10 uL浓度为40.52/ug/mL的槲皮苷对照品溶液，再精密吸取2 uL、3 uL、5 uL、5 uL浓度为405.2 ug/mL的槲皮苷对照品储备液溶液，进行线性化处理，得出 y=2818540.0992 x+26752.1830，相关系数 r=0.9999，说明槲皮素在样品体积0.0810-2.0260 ug之间有很好的线性关系。(3) 测定准确度。根据上述规定，将槲皮素作为对照品进样6次，测定其含量，相对标准偏差为0.35%，说明该仪器具有较好的准确度。(4)稳定性测试：根据所述的检测方法，在0小时，2小时，4小时，6小时，12小时，24小时，48小时取样，样品和对照品在各时间点的相对含量分别为0.68%和0.87%，说明样品和对照品在48小时之内均具有较好的稳定性。(5)重复性实验：对6个相同产品的相同产品进行了测定，结果显示，其平均质量分数为0.98%，相对标准偏差为0.73%，结果显示本实验的重现性较好。(6) 样品的加样加标法。将侧柏叶片冷冻干燥粉末（批次：191001)，每一份大约0.1克（总共9份），精确称量，将槲皮苷对照品分别以0.8倍、1.0倍和1倍当量的标准添加进去，精密称定并依次加入，其中低中高三水平样品各3份，并按方法制备样品并进样测定。结果：9种药材的槲皮素含量和相对标准偏差分别为99.23%和1.54%。(7) 试样的确定将15份冻干粉试样按照柏木冷冻干燥粉末试样的试验方法制成，并按照试验法进行测试，并算出各项指标的转换率。另外，对15批次的侧柏叶片冷冻干燥粉末，精确称量各批次样品29份，按照《中国药典》0832号《四部总则》0832规定的湿度测量方法（干燥）进行干燥试验。15批次的侧柏叶片中，槲皮素、槲皮素、槲皮素的含量分别为16.08%、0.91%、51.11%、67.16%和57.67%。

4. 采用引人法建立的方法对15批次样品进行了相似性分析，采用《中药色谱特征图谱相似度评价系统(2012.1版)》对15批次样品进行了相似性分析，其相似性都在0.90以上。研究发现，在不同流速、不同柱温及不同柱下，色谱峰的特征峰峰型清晰，具有良好的对称性和分离性，13个特征峰与对照品的参考色谱峰一致。结果显示，此工艺具有很好的耐久性。

三、探讨

通过查阅有关资料，我们了解到侧柏叶片中含有挥发油、黄酮和鞣质类等有效物质，在此基础上，我们参照有关文献，探索了侧柏叶片的指纹图谱，并将其与20%的甲醇作对照，得到了以20%甲醇为溶剂的样品，得到了许多具有明显差异的样品。

总之，本项目拟采集15批次侧柏叶煎液，以槲皮素为主要指标，测定15批次侧柏叶片的迁移及出膏率，构建侧柏叶片药材的指纹图谱，通过质谱鉴定10个指纹图谱，确定10个指纹图谱，为中药饮片的品质评估和药材品质监控奠定基础。

参考文献;

［１］刘红．浅谈侧柏叶标准汤剂制备及质量标准研究.2022.

［２］李继晓．侧柏挥发油成分及抗肿瘤活性的研究．2020．