液相色谱法测定软胶囊中的维生素B12

任艳琦，陈美花，林海滢，李金盛

广东省科学院测试分析研究所(中国广州分析测试中心)510000

摘要：本文建立了软胶囊中水溶性维生素钴胺素的高效液相色谱分析方法，该方法操作简便，耗时短。取适量软胶囊内容物，加入正己烷涡旋使其充分溶解后，加入适量纯化水振荡提取30分钟，离心后取上清液重复提取一遍，合并提取液于25mL棕色容量瓶中用纯化水定容至25mL，取样液过0.22μm水系膜然后用高效液相色谱-紫外检测器测定。结果显示， 维生素B12的线性相关系数（r2）≧0.999，样品浓度的精密度≦5.0%，加标回收率为90%~100%。该方法操作简便，分析时间短，回收率高，节省物力财力，稳定，准确，适用于软胶囊样品中钴胺素的检测。

关键词：维生素B12(钴胺素)；软胶囊；高效液相色谱-紫外检测器；

Determination of Vitamin B12 in Soft Capsules by Liquid Chromatography

Abstract: This article establishes a high-performance liquid chromatography method for the analysis of water-soluble vitamin cobalamin in soft capsules. The method is simple and time-consuming. Take an appropriate amount of soft capsule content, add n-hexane vortex to make it fully dissolved, add an appropriate amount of purified water to shake and extract for 30 minutes, take the supernatant after centrifugation and extract again, combine the extract solution in a 25mL brown volumetric flask, use purified water to fix the volume to 25mL, and pass 0.22 for the sample solution μ The water system membrane was then determined using high-performance liquid chromatography ultraviolet detector. The results showed that the linear correlation coefficient (r2) of Vitamin B12 was ≥ 0.999, the precision of sample concentration was ≤ 5.0%, and the spiked recovery was 90%~100%. This method is easy to operate, has short analysis time, high recovery rate, saves resources and finances, is stable, accurate, and suitable for the detection of cobalamin in soft capsule samples.

Key words: Vitamin B12 (cobalamin); Soft capsules; High performance liquid chromatography ultraviolet detector.

维生素B12，又名钴胺素，是最新型的维生素。它是现存维生中素最后被发现的，分子结构最为复杂的唯一一种含有金属元素的B族维生素，主要有两种活性形式，线粒体中的腺苷钴胺和细胞质中的甲基钴胺，是维持甲基丙二酸和同型半胱氨酸稳态所必须的[1]。VB12是人体中一种重要的微量元素[2]，且其含量会随着年龄的增加而逐渐减少，尤其是女性会因为其生理结构的原因减少得比男性快。维生素B12是一种无嗅无味，易溶于水的枚红色结晶粉末[3]，也可溶于低浓度乙醇，但不溶于丙酮、氯仿和乙醚，在pH值4.5～5.0弱酸的低温或室温条件下可稳定存在，在强酸（pH<2）或碱性溶液则会分解，遇热遇强光或紫外线也会有一定程度的破坏。

自然界中的维生素B12主要是通过草食动物的瘤胃和结肠中的细菌合成的，其天然存在于肉类和鱼类中，也存在于乳制品和蛋中[4]，豆制品经发酵会产生一部分维生素B12。因此，素食者比一般人容易缺乏维生素B12，经调查发现素食者发生维生素 B12 缺乏的风险是非素食者的 1.89 倍[5]。

维生素B12一般被称为造血维生素，参与制造骨髓红细胞，协助细胞再生，防止恶性贫血，防止大脑神经受到破坏[6]，是促进人体新陈代谢的重要成分。因此缺乏时容易导致：1、恶性贫血[7]（红血球不足）；2、复发性口腔溃疡[8]；3、眼睛及皮肤发黄，皮肤出现局部（很小）红肿（不疼不痒）并伴随蜕皮；4、可能引起人的精神焦虑抑郁[9]；5、头痛，记忆力减退，痴呆；6、脊髓变形，神经和周围神经退化等等。维生素B12因其具有让肌肤再生的优越功效[10]，因此在美容行业可用于淡化因岁数增长产生的细纹或皱纹，也可用于修护各种伤疤和疤痕，改善皮肤暗沉等问题。

目前维生素B12现有多种检测方法：1、高效液相色谱法[11]；2、微生物法[12]；3、分光光度计法[13]；4、液相色谱质谱法；5、原子吸收光谱法；6、毛细管电泳法；7、化学发光法；8、酶联免疫吸附测定法等。

1、实验部分

1.1仪器与试剂

1.1.1仪器

Agilent 126ll高效液相色谱仪；配紫外检测器；BSA224S型电子天平（精密度为1㎎），TDZ5-WS型湘仪低速离心机（4000r/min），IkA® KS 40000i control振荡仪，Millipore型超纯水发生器(明澈-D24UV)，Sartorius PH-10型PH计，上海青浦&XW-80A涡旋仪。

1.1.2样品与试剂

维生素B12软胶囊(商场随机购买)，甲醇(HPLC级，上海星可试剂有限公司)，磷酸二氢钾（GR，上海麦克林生化科技有限公司），磷酸（AR，上海麦克林生化科技有限公司），正己烷（HPLC级，上海星可试剂有限公司），实验用水由Millipore纯水系统制备。

1.2标准溶液的制备

准确称取适量维生素B12标准物质，加入纯化水超声溶解后，用纯化水稀释成浓度为100㎍/mL的储备溶液，置于4℃冰箱保存备用。

精确吸取5.000mL钴胺素储备溶液于25.00mL棕色容量瓶中用纯化水定容至10.00mL制得浓度为20.0㎍/mL的钴胺素中间储备液。再分别吸取钴胺素中间储备液0.500mL、1.000mL、1.500mL、2.500mL、5.000mL于10.00mL棕色容量瓶中，用纯化水定容至10.00mL，制得1.00㎍/mL、2.00㎍/mL、3.00㎍/mL、5.00㎍/mL、10.0㎍/mL标准溶液，临用前现配。

1.3样品预处理

1.3.1试样处理

取20粒软胶囊试样充分挤出内容物混匀。

1.3.2供试品溶液的配制

称取0.2g（精确至0.001g）软胶囊内容物于50mL离心管中，加入10mL正己烷试剂涡旋5分钟使其充分溶解，加入10mL纯化水,放入振荡仪中300r/min室温振荡30分钟后用离心机以4000r/min离心5分钟。取正己烷层重复提取一遍，合并两次提取液于25mL棕色容量瓶中，用纯化水定容至25.00mL，取样液过0.22 ɥm水相滤膜作为待测液。

注：若样品含量低于0.5㎍/g时，需要按照GB /T 5009.217-2008 5.2.2法进行富集、净化。

1.3.3回收率试验

称取0.2g（精确至0.001g）软胶囊内容物于50mL离心管中，加入维生素B12标准溶液适量，按“1.3.2”方法制备供试品溶液，上机测定并且计算维生素B12的回收率。

1.4液相色谱实验条件

色谱柱：C18柱（250nm×4.6mm，5ɥm）；

流动相：50mmol/L磷酸二氢钾溶液---甲醇（70：30）；

流速：1mL/min;

柱温：35℃；

检测波长：361nm;

进样量：20ɥL。

2、结果与讨论

2.1线性关系与检出限

将一系列维生素B12标准工作液按色谱条件进行分析，以溶液浓度为横坐标（C标），峰面积为纵坐标（A标），求得浓度关于峰面积的线性回归方程。线性范围、线性方程、相关系数见表1。表中可看出浓度与峰面积的相关系数（r2）≧0.999，表明该方法有良好的线性关系。

表1  维生素B12的保留时间、线性范围、线性方程和相关系数表

名称	保留时间(min)	线性范围(ɥg/mL)	线性方程	相关系数（r2）
维生素B12	10.8	1.00~1O.0	Y=54.383x-0.48424	0.9999

2.2实验的精密度

为了考擦软件囊中维生素B12含量的相对标准偏差（RSD），实验对软胶囊中维生素B12的含量测定做了6个平行样。结果见表2，如表所见，同一样品中维生素B12含量的RSD＜5%，说明该方法具有良好的精密度

表2  软胶囊中维生素B12实验的精密度

名称	样品含量（ɥg/g）	平均值（ɥg/g）	RSD(%)
维生素B12	375	374	0.1
	377
	380
	375
	369
	371

2.3加标回收率试验

比较两个加标样品的实际测得含量和理论加标含量，进而计算出维生素B12在样品中的回收率，结果见表3。可见，该样品处理方法能够得到较好的回收率，表明该方法可以准确地测定软胶囊中维生素B12的含量。

表3  软胶囊中维生素B12实验的回收率

名称	理论加标量（ɥg/g）	样品本身含量（ɥg/g）	实际测得量（ɥg/g）	回收率（%）	平均回收率（%）
维生素B2	331	374	695	97.0	97.4
	318		685	97.8

3、结论

本文建立了软胶囊中水溶性维生素钴胺素的高效液相色谱分析方法。优化后的方法相关系数（r2）=0.9999，回收率为97.4%，相对偏差为0.1%，线性好，回收率和精密度高，该方法处理简单方便，峰形良好，测定结果准确可靠，可以提高检测效率，可作为软胶囊中水溶性维生素钴胺素含量的测定方法。

参考文献

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