酿酒酵母工程菌株的构建与发酵优化

杨智华

身份证号码：512531197808290342

摘要：随着社会经济的迅速发展，酿酒酵母又称面包酵母或出芽酵母,是与人类关系最广泛的一种酵母；是酿酒工业发酵中最主要的菌种之一；是酒品质的灵魂，对酒体颜色、气味、口感的影响非常大。酿酒酵母具有安全、繁殖周期快、代谢快等特点；其生产过程容易控制，易于大规模培养生产，来源广，大量应用于酿造、医药、饲料工业等多个领域旨在通过优化发酵培养条件,提高酵母细胞密度,从而提高生产效率,降低生产成本,为之后的扩大培养使其进一步发挥其在食品发酵工业的作用提供理论依据,奠定实践基础。

关键词：酿酒酵母工程菌株；构建；发酵优化

引言

酿酒酵母是发酵生产燃料乙醇的最重要微生物，因为酿酒酵母的生长速度快，对糖的转化利用率高，并且人类对其开发利用的历史悠久，对其生物学特性已有充分了解。但是，酿酒酵母对高体积分数乙醇较为敏感，工业化的发酵体系中乙醇体积分数通常不能超过14%，被认为是燃料乙醇生产成本过高的最主要原因，这严重制约了燃料乙醇的商业化发展。基于此，对近年来在酿酒酵母的乙醇耐受、高温耐受和高渗耐受机制研究进行总结，并综合分析提高酿酒酵母应对各种胁迫的技术方案，为行业共同解决高体积分数乙醇发酵提供思路。

1酿酒酵母的耐受机制

温度作为影响酵母菌生长的重要因素，会影响酵母菌的酶活性以及对营养物质的吸收和利用，而不同的酵母菌对温度的耐受性也不同酿酒酵母的醇类耐受机制。乙醇作为酿酒酵母的主要代谢产物，虽然酿酒酵母对乙醇具有较高的耐受性，但仍对乙醇的毒性作用很敏感。随着发酵时间延长，乙醇体积分数升高，进而对酵母的生长产生抑制作用。酵母在发酵过程中能通过调节代谢来保证自身的正常生长，即产生乙醇耐受性。HSP编码基因可在乙醇的促使下合成特定的热激蛋白，能起到稳定细胞膜和蛋白质的作用，通过应激反应减弱乙醇对细胞的毒害作用，从而提高酿酒酵母乙醇耐受性。乙醇体积分数升高时，这些基因会被激活合成相关蛋白和海藻糖，增强酵母对乙醇的抵抗能力；其中海藻糖和脯氨酸可以防止蛋白质变性、减少膜的渗透性改变，海藻糖是细胞在环境胁迫下的应激产物；脯氨酸是一种渗透保护物质，可保护和维持生物大分子物质在胁迫环境下的稳定性，被认为是酵母对胁迫。

2材料与方法

2.1菌株

酿酒酵母Y013,由浓香型白酒酒醅筛选得到。

2.2培养基

筛菌培养基：蛋白胨5.0g/L，葡萄糖10.0g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，硫酸镁（无水）0.5g/L，琼脂0.0g/L，孟加拉红0.0333g/L，氯霉素0.1g/L，蒸馏水1000mL，自然pH，121℃灭菌20min。

斜面培养基：葡萄糖20.0g/L,蛋白胨10.0g/L,酵母浸出粉5.0g/L,琼脂14.0g/L，蒸馏水1000mL，自然pH，121℃灭菌20min。

发酵培养基：一份高粱粉，加水四份蒸煮0.5~1h，按淀粉酶使用说明加入淀粉酶进行液化，液化后补加55~75℃温水一份，搅拌均匀，在55~75℃糖化0.5~1h，用稀碘液试之不显蓝色，用细纱布过滤，测量溶液的糖度并调整为8~10°波美度，自然pH，115℃灭菌20min后使用。

2.3方法

采用10倍稀释法用无菌生理盐水将采集的样品（制曲原料、大曲以及窖泥等）稀释至10-5、10-6、10-7，分别吸取1mL稀释液转入筛菌培养基中，用涂布棒涂抹均匀，于28℃培养48h，待培养基表面长出单个菌落。根据菌落大小、颜色、透明度，筛选出具有酿酒酵母菌典型菌落特征的单个菌落，用接种针挑取单个菌落于平板上划线分离，划线分离3次后，用显微镜观察，挑选纯菌落，然后接种在试管斜面培养基上，28℃条件下培养48h后，于4℃保存备用。向样品瓶中加入35~40mL种子培养基，放入磁力搅拌子，盖上带透气膜和密封圈的上盖，灭菌冷却后在生物安全柜中以5%的接种量接入二级种子液。将样品瓶按照编号放入主机相应位置，主机屏幕或电脑控制软件上设置样品培养温度、搅拌速度、检测间隔时间等参数；待主机温度达到设定温度±2℃时，点击开始检测并记录数据。待样品分析结束后，可在“打开文件”中调取相关数据文件，根据需要对不同样品数据进行组合、比较分析，形成相关图谱。

3结果与讨论

通过单因素试验对酿酒酵母培养条件进行优化，以种子培养基为基础，培养温度、培养时间和转子转速为影响酵母菌株生长的显著因素。在工业发酵的生产中，培养基既是酿酒酵母的生存环境，也是其营养物质的主要来源，能够直接影响酵母的生长和代谢。发酵培养基的设计和优化在整个工业发酵中有着举足轻重的地位。通过对原有培养基成分进行配比和不同的试验设计方法，实现酿酒酵母对不同胁迫因素的耐受性增加，进而实现发酵产物的提高。当培养温度为26℃至30℃时，酿酒酵母的最大细胞密度随着培养温度的升高逐渐增高；当培养温度为30℃至34℃时，酿酒酵母的最大细胞密度随着培养温度的升高逐渐降低。其中培养温度为30℃时，酿酒酵母的最大细胞密度最高。当转子转速为50~150r/min时，酿酒酵母的最大细胞密度随着转子转速的升高逐渐增高；当转子转速为150℃至250℃时，酿酒酵母的最大细胞密度随着转子转速的升高逐渐降低。其中转子转速为150℃时，酿酒酵母的最大细胞密度最高。细胞膜是分隔细胞内、外物质的天然保护屏障，当细胞膜的通透性增加时，对细胞至关重要的蛋白质和核酸等物质就会泄露到胞外，使细胞功能受到影响。

因此，近年来葡萄酒发酵研究热点转向控制性地应用非酿酒酵母属酵母，主要采用与酿酒酵母同时接种混合发酵和顺序接种混合发酵两种方式，将非酿酒酵母属酵母在颜色、香气、口感和安全健康等方面的优势与酿酒酵母强发酵和强耐受的特点结合起来，酿造具有产区特色的高质量葡萄酒。燃料乙醇可替代化石能源，有利于绿色发展，符合国家安全需要；充分利用农林废弃物为原料，可以助力解决“三农”问题。近年来，我国燃料乙醇产业发展取得长足进步，但是相比于美国、巴西等国家，中国仍面临原材料供应不稳定、产业链不完整、竞争平台不公平等问题，严重阻碍燃料乙醇的发展进度。从技术开发和生产管理角度来看，发酵工艺和菌种问题是整个产业的核心所在。工艺方面主要在于提高发酵温度从而减少冷凝水的使用；乙醇发酵工业在降本增效问题上，更加关注对菌株的耐受性改造。通过了解酿酒酵母的生长代谢和耐受机制，通过过表达某些基因增酿酒酵母对特异性耐受性，通过对优良菌种的筛选获得最大效益的菌株进行培育，除以之外通过改良培养基的营养成分和插入重组质粒诱导育种出高抗逆性酵母菌株，将作为研究的主流方向。随着科技的进步，对酵母耐受性能的研究技术也会不断突破，更多优秀的品种有望应运而生，并在工业生产中实现大规模应用，发展前景十分广阔。

结语

综上所述，酿酒酵母可以在偏酸性环境中，在无氧的条件下，经过内酶的作用，把单糖分解为二氧化碳和酒精。目前，酿酒酵母主要加工成活性干酵母应用于葡萄酒工业，非酿酒酵母属酵母对极端环境的耐受性弱于酿酒酵母，因此，需要关注加工过程对非酿酒酵母属酵母活性的影响。提高酿酒酵母的发酵力，探究高发酵力酿酒酵母实验室最佳培养条件，对将来应用于酿酒生产具有指导意义。

参考文献

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