基于聚集诱导发光传感器与谱效导向的血必净抗凝血活性成分筛选研究

李子怡 ,田蒋为（通讯作者）

中国药科大学 江苏省南京市 邮编211112

摘  要：新冠肺炎在全球爆发后，严重影响了人类的健康。大多数危重症新冠病人都会发展成凝血功能障碍和伴有血栓并发症。血必净注射液（XBJ）和抗生素联合使用可降低脓毒症患者的死亡率。凝血酶是止血和血栓形成中的关键蛋白质。凝血酶的检测大多数依赖于酶联免疫吸附试剂盒，但其检测费用昂贵、易出现假阳性结果。筛选凝血酶抑制剂的方法主要有组合化学法、谱-效相关法、分子生物色谱法和网络药理学等，目前没有一种快速筛选中药的抗凝活性物质的方法。

荧光传感器以其超高的灵敏度、快速的响应速度、无创检测能力和良好的选择性引起广泛关注。聚集诱导发光（AIE）探针是一类在单分子状态下荧光微弱，而在聚集态下荧光强度显著增强的化合物。AIE探针具有微环境敏感性、高信噪比、高光学稳定性和高聚集发射效率的独特优势。因此，将AIE探针作为信号分子，为检测凝血酶活性和筛选凝血酶抑制剂开辟新道路。

关键词：聚集诱导发射，荧光传感器，凝血酶，抗凝血活性成分，血必净注射液

新冠患者凝血病的研究现状

新型冠状病毒（Corona virus disease 2019，COVID-19）患者是由于感染了一种在2019年爆发的全球性病毒-严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）的一类人群，这种病毒具有人传人、极易传播性、致命性等特点[1-2]。新冠患者根据其症状不同可分为轻度症状患者和重度新冠患者，轻度新冠患者的临床症状分为:呼吸系统症状(包括发烧、咳嗽、呼吸困难、咳痰、咯血、胸闷和咽痛)、消化系统症状（包括腹痛、腹泻、恶心或呕吐）和神经系统症状（包括厌食、疲劳、肌痛和头痛），如Figure 1.1所示。

图1.1 轻度新冠患者的三种临床症状[19]

新冠严重病例较容易出现急性呼吸窘迫综合症、败血性休克、新陈代谢、呼吸衰竭、多器官功能衰竭（Multiple organs failure，MOF）、急性冠状动脉综合症和弥散性血管内凝血[3-4]。研究显示约30%新冠患者会有新冠相关凝血病（COVID-19 associated coagulopathy，CAC）[5-7]。了解凝血障碍的病理机理对治愈新冠患者具有十分重大的意义。针对于SARS-CoV-2会对新冠患者产生快速促凝血作用，导致凝血功能障碍这一现象，越来越多猜测认为是内皮损伤、炎症激活、免疫系统和凝血之间的关系[8-10]（Figure 1.2）。血管紧张素转化酶（Angiotensin converting enzyme，ACE）存在于许多组织中，包括心脏，大脑，肾上腺皮质，肾脏，肺泡巨噬细胞，外周子宫，胎盘，血管组织和肝脏等[11-14]。SRAS-CoV-2通过病毒蛋白S和ACE2受体之间相互作用穿透宿主细胞。ACE2在血管紧张素II（Angiotensin II，AII）中正常分解，SRAS-CoV-2调节ACE2的降低可能引起AII的积累，从而促进凝血状态[15]。又一方面，SRASCoV-2进入这些细胞引起内皮细胞损伤，内皮细胞损伤的解剖病理学特征也证实了这一点[16]。内皮细胞损伤又进一步引起宿主的炎症反应造成过度的免疫激活和细胞因子激增，从而导致高凝状态和血栓的发生[17-18]。

图1.2 2019年冠状病毒血栓形成的可能机制及临床2019冠状病毒疾病[8]

COVID-19患者的尸检结果显示将近60%的死者有肺栓塞或原位肺动脉血栓形成，这也进一步表明血栓的形成对死亡率有直接的影响[20]，SARS-CoV-2可以引起一系列凝血系统的紊乱，血栓的形成与凝血酶激活直接相关。此外，凝血激活还会发展成弥散性血管内凝血[21]。多数重症COVID-19患者会进行体外膜肺氧合（Extracorporeal Membrane Oxygenation，ECMO）治疗，凝血障碍是ECMO最常见的并发症之一，也是ECMO失败的因素之一[22-25]。因此，检测凝血参数对COVID-19患者的生命健康具有重要的意义。虽然重症COVID-19患者临床表现了CAC的各种机制，但是凝血功能与疾病之间的关联尚不明朗。多种因素都可能导致血液处于高凝状态[25]（Figure 1.3）。组织因子（Tissue factor，TF）除了作为一种止血调节剂，还是凝血因子VII和VIII的高亲和力细胞表面受体和辅因子[26-28]。TF与VIIa因子复合并激活凝血系统,导致凝血酶和纤维蛋白的生成。此外，凝血因子还可以激活血小板的级联，导致凝血反应[29-33]。

图1.3 TF在COVID-19相关性凝血病（CAC）中的研究进展

[34]

在SARS-CoV-2感染期间，Xa/凝血酶的TF依赖性激活和过多的纤溶酶原激活物抑制剂-1导致富含纤维蛋白的血栓形成。TF的过表达和多种机制相关，例如：直接感染I/II型上皮细胞和单核细胞；模式识别受体激活（TLR-3/-7/-8）；补体介导的MAC（C5b-C9）和过敏毒素（C5a，C3a）以及一些免疫和非免疫细胞过量释放细胞因子白细胞介素-1（Interleukin-1，IL-1）、IL-6、IL-8和肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α），会导致屏障功能障碍、通透性增加和凝血激活[34]。

1.2 血必净注射液治疗新冠重症患者的药理作用

1.2.1 血必净注射液的研究现状

XBJ是中药复方制剂，由当归（Angelica root; Angelica sinensis）,丹参（Salvia; Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma），赤芍（Red Paeoniae Trichocarpae; Paeoniae Radix Rubra）,川芎（Szechuan Lovage Rhizome; Ligusticum chuanxiong Hort）红花（Safflower; Carthami flos）组成。研究显示XBJ可以减少炎性细胞因子的释放，增强抗氧化应激能力，改善凝血功能障碍和改善微循环的功能[35-36]。2004年，中国食品药品监督管理局（Food and drug administration，FDA）批准将XBJ作为全身性炎症反应综合征、器官衰竭综合征、ALI和败血症等疾病的临床治疗药物[37]。

1.2.2 脓毒症的研究现状

脓毒症从希波克拉底时代开始被人们定义[38]。从数千年演变到至今，没有一种能够持续挽救脓毒症患者生命的治疗方法。脓毒症会引起免疫和非免疫系统内部产生不适应反应，从而导致器官功能障碍甚至是死亡。通常对脓毒症患者采取保健改善的手段。目前脓毒症解释为机体感染后的宿主反应失调造成生命器官功能障碍，严重时会危害生命安全[39]。脓毒症常伴有多器官功能障碍综合征（Multiple organ dysfunction syndrome，MODS），在危重和老年患者中具有极高的发病率和死亡率。新冠重症患者大多数表现为脓毒症，严重影响了患者的生命健康。XBJ是由经典配方-血府逐瘀汤转化而来的，在2004年被FDA批准，直接针对脓毒症和MODS的治疗。XBJ通过抗细菌、抗炎症、抗内毒素等途径阻断脓毒症的进展，是提高患者存活率的有效药物[40]。

图1.4 脓毒症的发展[38]

1.2.3 血必净注射液治疗新冠重症患者脓毒症的药理作用

(1)血必净注射液调节免疫功能

SARS-COV-2引起的病毒性脓毒症的病理过程有两个阶段：早期的细胞因子风暴和后期的免疫抑制。目前临床上对早期细胞因子风暴的治疗和临床研究非常重视,但是忽略了后期的免疫抑制阶段。处于后期阶段的患者免疫力低下,常出现二次感染,MOF和MODS导致新冠患者的情况迅速恶化甚至死亡[41]。

近年来人们逐渐认识到不仅大量炎症介质会导致脓毒症，机体免疫调节失调造成的抗炎和促炎介质平衡紊乱也会促进脓毒症的发展。在组织学上，人类急性肺损伤（Acute lung injury，ALI）主要表现为肺部重度急性炎症反应[42]。临床研究已经证明TNF-α和IL-1β的过度表达可以诱导ALI[43]。吕少敏等[44]发现XBJ可以降低脓毒症患者血浆前降钙素水平,并下调促炎介质TNF-α、IL-1β、IL-6，减少脓毒症死亡率。XBJ可以改善外周血中性粒细胞的趋化、吞噬、氧化呼吸爆发和调节机体的免疫功能[45]。此外XBJ能明显降低脓毒症大鼠血液中内毒素水平,提高脾淋巴细胞表面人白细胞DR抗原百分比，促进淋巴细胞增殖，降低脾淋巴细胞半胱氨酸蛋白酶-3阳性细胞表达，从而改善了脓毒症的特异性免疫功能状态[46]。苏伟等[47]通过观察患者治疗前后血清的炎症因子的变化，得出XBJ可降低重症脓毒症患者机体炎性反应,纠正细胞免疫功能紊乱。

(2)血必净注射液的抗氧化作用

脓毒症导致的脑损伤病理机制，包括线粒体和血管功能障碍、氧化应激等[48]。氧化应激会诱导丙二醛和髓过氧化物酶产生活性氧，抗氧化治疗是脓毒症研究中非常重要的领域[49]。刘佳等[50]发现XBJ提高脓毒症大鼠的生存率和改善脓毒症ALI反应的机制可能通过降低大鼠肺组织活性氧活性,增强超氧化物歧化酶活性,降低高迁移率族蛋白B1水平。朱云海等[51]研究发现XBJ能抑制脓毒症大鼠低氧诱导因子-1α及其靶基因诱导型一氧化氮合酶的表达。研究表明脓毒症发病机制的关键点之一是血管内皮细胞氧化应激反应，内源性一氧化氮合成酶（Endogenous nitric oxide synthase，eNOS）脱偶联则是脓毒症血管内皮细胞氧化应激的主要原因，而血管内皮细胞氧化应激又进一步促进了eNOS脱偶联

[52]。张晓菲等[53]发现XBJ能够减轻脓毒症血管内皮细胞的氧化应激,其可能机制与降低eNOS脱偶联有关。氧化应激和炎症“风暴”会导致脓毒症ALI，因此改善肝功能有助于脓毒症患者的预后[54-56]。孙雪东等[57]发现XBJ可以加强清除氧自由基能力，减轻肝组织的氧化损伤，稳定细胞膜的通透性，抑制细胞炎症因子，改善肝功能。

(3)血必净注射液的抗炎作用

由于XBJ的组成复杂，故缺乏对XBJ网络药理学治疗脓毒症的系统性作用机制研究。在中医理论中，XBJ用于中医发热性疾病。具有“清热解炎”的功效。临床研究发现重症脓毒症患者的细胞因子水平，如TNF-α和IL6会有明显的升高[58]。而重症脓毒症患者使用XBJ治疗一周后，TNF-α、IL6和IL-1β的血清浓度呈现显著降低[59-60]。最近网络药理学结合实验验证以及临床结果分析研究发现分子IL-10、TNF-α、IFN-γ、VEGFA、IL-8是生物分子网络中的关键节点。Figure 1.5有效揭示XBJ治疗脓毒症可能的抗炎作用。发现了XBJ调节通过靶向富含NF-κB信号通路，降低了NF-κB信号通路中关键基因的表达（如TNF-α、IL-1β、NFκb2、IL8、IL6的释放），从而调节促炎/抗炎平衡[61]。

图1.5 XBJ的中药-化合物-生物功能模块-分子网络[61]

(4)血必净改善脓毒症患者凝血功能障碍

大多数脓毒症都患有凝血功能障碍，常表现为微循环障碍，微循环障碍会导致毛细管密度的降低、无流量和间歇流毛细管的增加，导致氧气输送减少，凝血机制异常以及血栓的生成[62]。多种炎症介质和细胞因子可能直接或间接混淆机体的凝血功能。研究表明XBJ可以改善内毒素致脓毒休克的空肠绒毛的微循环和灌注血管的比例，改善脓毒症患者的凝血功能障碍，对机体起着保护作用[63]。

1.3 检测凝血酶活性和筛选中药活性物质的研究进展

1.3.1检测凝血酶活性的研究进展

凝血酶作用于凝血过程的最后一步，将可溶性的纤维蛋白原转变成不溶性的纤维蛋白，达到快速有效止血的目的，在凝血级联反应中起重要作用。凝血酶异常与血栓形成密切相关。目前检测凝血酶的方法有生物化学法和免疫学方法。生物化学法是指以酶学方法为基础，根据测定产物的吸光度的变化推算待测物的含量。免疫学方法是指利用抗原抗体特异性结合达到对被测物定性和定量检测，目前免疫学方法包括免疫比浊免疫扩散、放射免疫、酶联免疫吸附测定（Enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）和免疫电泳法等。常用仪器和试剂盒有全自动血凝仪、自动生化分析仪以及ELASA试剂盒。干化学技术是通过测定惰性顺磁铁氧化颗粒移动或摆动幅度的大小变化，来反映纤维蛋白生成或溶解的动力学特性，常使用光电检测器。检测凝血酶的方法还在不断地被发掘，例如比色传感器[64]、荧光光谱[65]、表面增强拉曼散射[66]、表面等离子体共振[67]、电化学应用传感器[68]、电化学适体传感器[69]、化学发光传感器[70]和化学发光生物传感器[71]。在某些领域，这些方法满足了要求，但仍有一些缺点，例如：灵敏度低，选择性低，仪器昂贵、操作复杂、实验条件严格和复杂的热循环步骤。

1.3.2中药活性物质筛选的研究进展

中药药效物质基础是研究中药的关键的科学问题，有助于我们擅明XBJ的药理作用机制，揭示其组方内涵。中药活性的筛选手段有：基于成分分离及活性追踪的筛选，基于计算机虚拟技术的筛选，基于亲和超滤质谱技术的筛选，基于血清药物化学的筛选，基于肠道菌群技术的筛选，基于代谢组学方法的筛选，基于分子识别技术的筛选，基于谱-效关系的筛选，基于血清药理学的筛选等[72-73]。

(1)基于传统成分分离及活性追踪的筛选：

对天然药物研究化学组分进行提取、分离和鉴定后，再使用药理模型测定化学组分的生物活性，以明确中药药效的物质基础。但在中药的提取分离的过程中会出现生物活性成分丢失和活性成分的活性降低的现象。

(2)基于血清药物化学及血清药理学的筛选：

将中药口服给药后对入血成分进行分析鉴定，来确定主要活性成分。其缺点一是：含量和血药浓度偏低的成分在富集、分离、鉴定环节存在一定的困难。二是：活性成分不等于入血成分。三是：动物个体差异较大，影响因素较多，因此存在很大程度上的不确定性。四是：随着时间的不同，体内的代谢产物可能会发生变化。

(3)基于计算机虚拟技术的筛选：

网络药理学就是基于计算机虚拟技术来达到筛选中药活性成分目的的方法。利用不同学科数据库结合计算机强大的编程建模预测药物的活性成分。从不同的学科层面来研究和分析中药的活性成分、作用机制等相关科学问题，得到广泛的应用。但网络药理学预测靶点是通过预测单味中药成分靶点叠加而成的，故而数据库预测的靶点信息准确性较低以及网络药理学预测的药物活性成分和靶点需要动物实验甚至临床试验来验证其准确性。

(4)基于亲和超滤质谱技术筛选：

亲和超滤作为一种新兴高通量筛选技术，不仅能够从复杂的体系中筛选出天然活性成分，而且能够保留溶液中天然蛋白质-配体相互作用，为快速筛选和鉴定中药活性成分提供了良好的办法。但小分子与靶标的非功能位点结合时会出现假阳性结果[74]。

(5)基于肠道菌群技术筛选：

中药活性成分和肠道菌群的作用是双向的，中药活性成分不仅可以改变肠道菌群的代谢功能，也可被肠道菌群转化或代谢[75]。但中药活性成分进入肠道被代谢后变得更加复杂，故基于肠道菌群技术筛选的中药活性成分也需要进一步验证。

(6)基于谱-效关系的筛选

中药谱-效关系研究作为一种常用的中药物质基础的研究方法，是将中药指纹图谱上的化学信息和体内、体外药效结果相结合，利用适当的数据处理技术，达到辨识活性成分及活性成分群的目的[76]。目前，基于谱-效技术筛选中药活性成分也存在一些局限性，如需要多种先进技术和方法相互佐证和全面表征以保证结果准确可靠。

目前的这些筛选中药活性成分方法各有优势，但在应用方面受到一定的限制。中药有效活性成分或活性成分群的研究是中药现代化开发的必经之路。随着近年来新检测技术的不断发展，中药有效活性成分追踪筛选技术不断提升，运用多学科联合筛选方法，已然成为中药有效活性成分的研究趋势。

1.4 荧光传感器为检测凝血酶活性和筛选抗凝血物质提供新方法

1.4.1 荧光传感器的发展历程

光学探针是与目标物质相互作用或者反应后的光学（吸光、荧光或发光）特性会发生改变的分析试剂。光学探针的特点是通过向无光学或弱光学物质提供强光学响应，使原先无法进行或难以进行的光学分析变的可能[77]。故光学探针显而易见的优势就是改善分析的灵敏度，也是揭示生物功能的重要传感与成像工具。

传感分析是一种分析检测技术，即利用光信号变化而开展的光传感分析。光学探针与传感分析的里程碑进展如下：古罗马时期出现第一个显色分析；1565年首次观察到荧光现象；1852年首次解释荧光机理；1867年荧光分析Al3+；1871年合成出荧光素；1911年出现第一台荧光显微镜；1978年出现第一台共聚焦显微镜；1985年出现第一个比率型荧光探针；1994年出现绿色荧光蛋白；2006年使用高分辨荧光分析。目前光学探针的传感分析主要设计紫外、可见和近红外区域的光。

1.4.2 荧光传感器的分类

光学信号的响应模式有猝灭型（On-off）、打开型（Off-on）、比率型（Ratiometric）和其他等。

(1)猝灭型荧光响应模式又称为荧光关闭型，猝灭型过程分为静态猝灭和解除猝灭。荧光猝灭广泛应用于金属离子、药物分子与生物大分子的相互作用研究[78]。

(2)打开型响应模式又叫荧光增强型，指荧光探针与分析物反应后荧光信号增强的现象，常在生物体系中应用[79]。

(3)比率型荧光响应：是利用一个荧光染料在两个不同波长下的荧光强度比值来反映目标物质的浓度或活性，常基于两种光物理过程设计，一是ICT，二是荧光共振能量转移。目前已用于阳离子检测、细胞和小鼠活体H2S的荧光成像分析[80-82]。

1.4.3荧光传感器的应用

目前荧光传感器已经被广泛使用[83]，例如用于离子（金属离子和阴离子）、小分子（氨，酚，硫醇，氨基酸，活性氧物种）和大分子（蛋白酶，核酸）的检测；环境敏感型（极性敏感，粘度敏感，温度敏感，压力敏感，酸度敏感）的光学探针的分析应用；细胞器光学探针（细胞膜、溶酶体、内质网等细胞器靶向）的分析应用[84]。

1.4.4聚集诱导发光荧光传感器的独特优势

凝血酶是一种在生理和病理凝血中重大作用的丝氨酸蛋白。对于凝血酶检测，目前已经开发出多种方法，例如“1.3.1项”提到的生物化学法、免疫学方法、比色传感器、荧光光谱、表面增强拉曼散射、表面等离子体共振、电化学应用传感器、电化学适体传感器、化学发光传感器和化学发光生物传感器等，这些方法可以在一定程度上满足需求，但仍有一些缺点，例如操作复杂，仪器昂贵和严格的实验条件等。中药活性成分的筛选方法，有“1.3.2项”所提到的基于计算机虚拟技术、基于成分敲出技术、基于肠道菌群技术、基于代谢组学技术、基于谱-效关系和基于分子识别技术的筛选等。目前筛选中药活性成分的方法存在一定的不足和应用上的局限性。因此，建立一种快速、简单的用于检测凝血酶和筛选中药抗凝血活性成分的方法至关重要。聚集诱导发光（AIE）探针的特点是在单分子状态下呈现微弱荧光甚至观察不到荧光，而在聚集状态下荧光显著增强的一类分子。AIE探针结构常包含大的共轭结构，因而可以避免聚集诱导猝灭（ACQ）现象，具有微环境敏感、斯托克斯位移大、高信噪比、高光稳定性和聚集态发射效率高的独特优势[85]。以四苯乙烯衍生物（TPE1）为例，TPE1分子在稀释溶液中几乎无发射，这是因为与烯烃相连的苯环旋转耗尽了激子能量。相反，在聚集时，由于苯环分子的旋转受到封闭环境的限制，扭曲的分子构象阻碍了π-π堆积，从而激活了辐射跃迁通道并显示强烈的荧光发射（Figure 1.6）。因此，AIE探针的出现为构建一种快速同时用于凝血酶活性的检测和筛选中药抗凝血活性成分的方法带来了新契机。

图1.6 螺旋桨状TPE1在溶液状态下没有发射，但在聚集状态下显示荧光[86]

中药药效物质基础的辨识是中药现代化的必经之路，需要不断开发出新方法以及新技术研究中药的活性物质，从而揭示中药的药效物质和药理作用，以及中药组方内涵，传承和发扬我国瑰宝。目前运用多学科联合筛选方法，已然成为中药有效活性成分的研究趋势。聚集诱导发光探针因具有高信噪比、高光稳定性和响应迅速等优点，促进了荧光传感器在中药药效物质基础的辨识上的应用，有助于天然的抗凝血药物的开发和中药药效物质基础的阐明，为探索中药的整体物质基础提供了一种新型有效的手段。

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