HPLC法快速筛查保健食品中非法添加的化学药品

张铭涛

　云浮市食品药品检验所   广东省云浮市　　527300

摘要：目的 我们需要建立一种基于HPLC的快速筛查方法，以检测改善睡眠类保健食品中非法添加的七种化学药品，包括卡马西平、氯丙嗪、舒必利、奥卡西平、奥氮平、多赛平和喹硫平。方法 分离采用HPLC法，使用C18柱 (4.6×250mm，5μm)实现；检测波长为250nm；柱温保持在35℃。流动相使用甲醇和0.02mol/L磷酸二氢钾溶液的梯度洗脱方法。结果 在对HPLC法进行考察与分析后发现，七类目标分析物的线性范围、检出限、定量限、方法重复性（RSD）、仪器精密度、平均回收率分别为20至600μg/ml、0.4至2.5ng/g、2.5至5.0ng/g、0.1%至3.6%、0.2%至2.8%、95%至102%；三十二小时内，7类成分溶液处于较为稳定状态。结论 采用HPLC法对保健食品中非法添加物进行检验，具有操作便捷、准确的优点，此外保健食品中含有的卡马西平等七类非法添加化学物也能够在较短的时间内被检测出来。

关键词:改善睡眠类保健食品；HPLC法；非法添加化学药品

在当今社会，由于生活节奏不断加快，人们面临的工作压力越来越大，导致失眠患者的数量逐年增加。为改善睡眠，越来越多的人群选择使用药物进行干预。一些不法分子利用了现代人们的这一虚情，在保健食品中非法添加镇静催眠类化学药物。这种非法添加行为不仅会对消费者的身体健康造成威胁，而且还会对市场秩序产生负面影响[1]。对于这一问题，国家局已经颁布了三种用于补充检验方法，这些方法中共收录了22种可能会被非法添加到食品中的化学药物。除了前文提到的22类药物，还存在一些能够对睡眠形成改善作用的精神类药物，也可能被添加至各类保健品中，并对人体造成不同程度的伤害。这些药物大部分已被纳入国家二类精神药物，例如氯丙嗪，它是一种抗精神病药，具有神经安定功能，但经常服用很容易使人们产生耐药性。基于以上原因，对睡眠改善保健食品中非法添加的其他精神类药物实施检测是具有重要意义的。为了实现这一目标，本研究提出了一种基于HPLC（检测器采用DAD）的检测方法，可以用于检测睡眠类保健食品中非法添加的卡马西平、氯丙嗪、舒必利、奥卡西平、奥氮平、多赛平和喹硫平等七类精神类药物。这些药物可能会对人体产生严重的副作用，因此对其进行及时、准确的检测具有极其重要的意义。

1仪器和试药

1.1仪器

本次研究使用的仪器有SHIMADZU  LC-20AT 岛津高效液相色谱仪、梅特勒XSR205DU/A电子天平以及超声波提取仪。

1.2试剂和对照品

磷酸二氢钾，分析纯；甲醇，分析纯(提取)、色谱纯(流动相)；盐酸，分析纯。对照品均来源于中国食品药品检定研究院:卡马西平(批号:100142-201105，规格:100mg，含量99.8%；富马酸喹硫平(批号:100815-201904，规格:100mg，含量99.9%)；盐酸氯丙嗪(批号:100460－201302，规格:100mg，含量99.7%);奥氮平(批号:100948－200801，规格:100mg，含量99.9%)；盐酸多塞平(批号:100069－201103，规格:100mg，含量99.5%)；奥卡西平(批号:100657－201102，规格:100mg，含量99.8%)；舒必利(批号:100203－200503，规格:100mg，含量100%)。31批次样品来源于2015年全国保健食品监督抽检任务辅助睡眠类保健食品中不含褪黑素的样品。

2方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱为Agilent的C18柱，规格为4.6毫米×毫米，5μm)；色谱柱温度为35摄氏度；流动相为甲醇0.02mol/L以及磷酸二氢钾溶液，下表1中列出的数据是梯度洗脱。检测波长与流速分别为250nm、每分钟1ml，如表1所示。

表1梯度洗脱表

时间(分)	甲醇	磷酸二氢钾
0～55分钟	5%～95%	95%～5%
55～64分钟	95%	5%
65～75分钟	5%	95%

2.2供试品制备

首先，将服用的样品精确称取至容量为50毫升的瓶子中，在其中加入40 毫升的甲醇，并通过超声对其提取十五分钟。然后，让样品放置至室温，再用甲醇加至液面刻度，以得到稀释后的标准浓度样品待测液。接着，通过0.45μm的膜过滤器过滤样品，取出过滤后的液体作为样品的测定液备用。

2.3标准曲线的制备

首先，需要对七种对照品进行精密称定，每一种对照品的称定量都为12mg，将其分别放入25毫升的容量瓶中。随后，使用20毫升的甲醇对卡马西平、富马酸喹硫平、盐酸多塞平和米氮平四类对照品进行溶解处理，同时使用20毫升的乙腈对奥卡西平、舒必利和奥氮平三种对照品进行溶解处理。这样能够确保对照品的溶解度保持合适水平，加对应溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品的储备液，为后续实验做好准备。接下来，需要量取对照品储备液各1.0ml，并分别放入同个10毫升的量瓶中，通过甲醇对其进行稀释，直到达到刻度线，摇晃均匀，将其制成每毫升约含50μg对照品的溶液。这样能够将对照品的浓度稀释到适宜范围内，从而使得实验数据更加准确和精确。随后，取5毫升稀释至10.0ml，并摇晃均匀，通过这种方式来制备浓度不同的对照品，使得标准曲线控制在20至每毫升600μg范围内。

2.4稳定性试验

在完成对照品储备液的配制后需将其放于冰箱内进行冷藏保管，选择不同时间段对其进行峰面积检测，对RSD进行计算，选择对照品测试溶液，对其稳定性实施检测，最终结果显示三十二小时内各项指标结果均保持稳定状态。

2.5选择检测波长

由于各种化学药品的吸收波长最大值各有差异，因此本次研究中选择250nm作为大部分物质吸收值的最高波长。

2.6考察仪器精密度

将浓度处于标准曲线中间的对照品溶液作为样品，对其实施五次连续取样，对峰面积的RSD进行计算，得到的仪器精密度RSD低于5%。

2.7重复性实验

以加标样替换样品，对其实施重复性试验，从对照品溶液中依次取1毫升，将其放入五个10毫升的容量瓶中，确保五个容量瓶中都以放入称取样品，加入甲醇直到刻度线，放入10μl样品，对样品中各组分的量进行测量。最终显示重复性试验结果满足要求。

2.8准确度

通过加样回收法对准确度进行测定。准确提取某口服液1毫升，将其倒入九个容量为10毫升的实验瓶中，再向其中依次倒入九个浓度为每毫升0.4695毫克的对照品溶液，其中1毫升、0.8毫升以及0.4毫升的各三瓶，每瓶均加入8毫升左右的甲醇，对其进行15分钟超声处理后提取定容至10毫升。取续滤液后加入10μl的样品，对回收率进行测算后得出回收率大于95%且小于102%。

2.9检出限、定量限

缓慢稀释加标样品溶液后对其进行过滤处理，随后取样，将对照品浓度设定为10比1，在包含称样量和稀释体积的情况下对定量限进行折算；将对照品浓度设定为3比1作为检出浓度，在此基础上计算出检出限。得到的检出限以及定量限分别为0.4至2.5ng/g、2.5～5.0ng/g，具体数据参见下表2。

表2检出限与定量限

成分	检出限(ng/g)	定量限(ng/g)
卡马西平	0.51	2.4
氯丙嗪	0.53	2.7
舒必利	0.62	2.8
奥卡西平	0.39	2.6
奥氮平	0.46	2.5
多赛平	0.47	2.6
喹硫平	2.48	4.9

2.10样品测定

在本研究中所涉及的31批样品中，以每种样品10μl的方式进行取样，采用验证法进行测定后并未发现存在非法添加物质。

3讨论

本研究是为了探讨睡眠性保健食品中非法添加剂的初筛方法，在供试品溶液中，禁止存在与对照品溶液保留时间完全相同的色谱峰，即使存在也应确保它们具有不同的光谱图，若色谱保留时间、光谱图都和对照品相同，那么测定可通过液质联用仪完成，从而避免干扰[2]。在被试的溶液中，如果出现了与对照品溶液保留时间、光谱和质谱都相同的色谱峰，那么就可将其判断为存在非法添加，通过上述方法定量。纵坐标和横坐标分别设置为峰面积、不同的进样浓度，坐标取曲线，样品峰面积作为输入后求出待测溶液的浓度。在选取7种违禁添加物时，参考了文献中已筛选出的9种安眠药，但在这9种违禁药品中，由于米氮平、盐酸西普肽兰因的稳定性较差，因此不包括在此次的方法学研究中。采用甲醇-磷酸二氢钾，乙腈-磷酸二氢钾作流动相，对其进行了梯度淋洗，结果表明，采用甲醇-磷酸二酸钾的淋洗，可以获得较好的色谱峰分离性，且具有较理想的试验结果。因此，本研究最后采用了甲醇-磷酸二酸钾梯度洗脱。

参考文献：

[1]吴婉琴, 江丰, 范小龙,等. 高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱快速筛查鉴别食品中非法添加的62种中药材[J]. 色谱, 2022, 40(01):48-56.

[2]许晓辉, 杨志敏, 吴兴强,等. 超高效液相色谱-串联质谱法快速筛查中成药中49种违法添加化学药物[J]. 分析测试学报, 2021, 40(05):726-731.