低温环境诱导下急性大鼠肝损伤模型的建立

尹丹萍1 ,刘同亭2 ,董俊峰3,王晓宇4

（1,4.解放军第960医院疾病预防控制科  山东济南 250031；2. 解放军第960医院3.解放军第960医院普通外科）

【摘要】目的：1.建立-10℃低温冷冻箱环境下急性大鼠肝脏损伤模型；2.研究冷刺激诱导下急性肝脏损伤的机制；方法：建立-10℃低温环境诱导下的急性大鼠肝损伤模型，通过检测大鼠血清中ALT、AST等指标的变化，观察大鼠肝脏病理的改变，以研究低温环境诱导下大鼠急性肝损伤的发生机制。结果：经过2h、4h、6h进行低温暴露后，4h模型组ALT、AST水平对比正常组升高明显，具有显著统计学意义（P＜0.01），实验数据表明，大鼠4h冷暴露后造模成功，且6h冷暴露后大鼠肝功仍能维持一定的损伤的程度。结论：本实验建立了一种操作方便，易复制的低温环境诱导下急性大鼠肝损伤模型。

【关键词】低温环境；急性肝损伤；大鼠模型；机制

本实验通过将大鼠置于-10℃低温冷冻箱环境中建立急性肝细胞损伤大鼠模型，连续观察大鼠分别于2h、4h、6h后血清检验指标ALT、AST等指标，并进行病理学检测以确定大鼠肝细胞损伤造模成功时间，以及不同冷暴露时间下肝细胞损伤及凋亡的情况，为探讨冷刺激诱导下肝脏损伤的机制，并为对比中、西药在改善冷刺激诱导下急性肝细胞损伤时的疗效评估提供依据。

资料与方法

1.材料：采用清洁雄性大鼠75只，体重约180-220g，来源于山东大学动物实验中心，室内温度22℃±1℃，采用12小时光照，12小时黑暗循环动物房。适应性饲养一周后，随机分为2组，正常温度组（N=15），冷暴露组(N=60)，冷暴露组分为实验组（N=45）、造模组（N=15）,并将冷暴露组大鼠置于-10℃低温冷冻箱中，造模组冷暴露前7天灌服蒸馏水，冷暴露组大鼠分别暴露时间为2h、4h、6h三个时间点，每个时间点20只大鼠，每个铁丝网笼放5只大鼠，造模期间可适当进食、水，正常温度组放置于22±1℃的环境中，造模期间正常饮食。

2.标本采集

2.1 血清学检测

于2h、4h、6h分别处死2h模型组、4h模型组大鼠、6h模型组大鼠。处死前，大鼠30min内不能进食、水，水合氯醛麻醉大鼠，大鼠腹主动脉采血于抗凝管分装并标记，将所取血液静置40min，3000转离心15min分离血清，严格按照试剂盒操作标准检测血清学指标。

3.观察指标及测定方法

3.1血清指标检测

与正常组相比，不同冷暴露时间下2h模型组、4h模型组、6h模型组的大鼠肝功指标ALT、AST活力增加，6h模型组较4h模型组的ALT、AST活力相比4h模型组较2h模型组活性增加幅度降低，但仍高于4h模型组，其中，4h模型组ALT、AST活力相比正常组增加明显，具有显著统计学意义（P<0.01），6h模型组ALT活力相比正常组增加，具有统计学意义（P<0.05），6h模型组AST活力相比正常组增加明显，具有显著统计学意义（P<0.01）。2h模型组ALT、AST活力相比，虽然指标水平均有所上升，但较正常组均无明显统计学意义（P＞0.05）。（见图1-1）

图1-1各组大鼠血清肝功能指标ALT、AST的检测

根据图1-2我们可以发现，在升高ALT活力方面，4h模型组、6h模型组均较2h模型组具有统计学意义（P<0.05），但6h模型组虽然在升高ALT活力方面高于4h模型组，但无明显统计学意义（P＞0.05）。

图1-2各模型组大鼠血清肝功能指标ALT、AST的检测

3.2病理学观察

（1）肉眼观察：

正常组大鼠肝脏色暗红，被膜光滑，质地柔软，边缘锐利，有弹性。冷暴露2h后大鼠肝脏体积未见明显变化，色暗红，外形饱满，边缘略钝，被膜未见紧张。冷暴露4h后大鼠体积可见增大，外观颜色加深，边缘较钝，包膜紧张，质地脆；冷暴露6h后大鼠肝脏体积明显增大，外观呈深暗红色，边缘较钝，包膜紧张，质地脆。

（2）光镜下观察：

冷暴露2h后病变区域肝细胞呈局灶性炎性改变，肝小叶结构无明显重构，仍可见门管区结构，周围肝细胞大小较一致。

冷暴露6h后肝细胞肿胀明显，明显出现小叶内炎症性浸润及局灶性脂肪变性，炎症细胞主要以单个核细胞为主，炎症程度明显加重，出现抱团状，可见凋亡细胞出现。

4.统计学分析

所有数据均以spss21.0软件进行处理分析，计量资料用（x±s表示），多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验，P＜0.05有统计学意义，P＜0.01表示统计有显著意义。

讨论

体内氧化剂与抗氧化剂的失衡是造成肝损伤的主要原因。在寒冷环境的刺激下，以过氧化氢（H2O2）、氧阴离子(O2-)、羟自由基(OH) [8]为代表的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）大量的生成，O2-作为自由基，容易被线粒体中Mn-SOD转化为H2O2，而H

2O2稳定性好，相比O2-更容易跨越线粒体内膜，发生氧化还原反应[9]。同时，超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、过氧化氢酶（CAT）等抗氧化剂开始与活性氧簇发生作用，降低氧化剂对肝细胞的损伤，如SOD可以将有害的O2-转化为过氧化氢[10]。随着冷刺激时间的延长，ROS的含量远超出了组织线粒体的自身清除能力而产生蓄积，加上大量中间产物如丙二醛的沉积对细胞膜造成损伤，使肝细胞水肿、变形甚至坏死[11]。所以当氧化应激发生时，有效提高抗氧化剂的活力，对减少肝细胞的损伤至关重要[12]。

肝脏酶学指标ALT、AST，作为临床中应用最广泛的血清学指标，最直接体现肝脏的损伤情况，其中，ALT在肝脏中的含量最高，宋国培等认为只要有1%肝细胞有病变, 即可使血清中的 ALT活性升高一倍[13]，而 AST活性的增加在排除心肌损伤的情况下， 可考虑肝脏病变[14]，其中 AST60%存在于肝线粒体内，因此当血清学中AST显著增加时，可以认为肝脏线粒体遭到大量破坏，乃至肝细胞坏死[15]。2h、4h、6h模型组大鼠ALT、AST活性明显增加，2h模型组对比正常组大鼠肝功指标无显著性差异，随着冷暴露时间的延长，4h模型组肝功损伤明显增加，与正常组大鼠肝功指标对比具有统计学意义，根据病理学结果，发现随着冷暴露时间的延长，肝损伤加重，可证实血清学指标的检测的可靠性。

本实验通过模拟寒区低温冷环境，建立了-10℃低温环境诱导下的急性大鼠肝损伤模型，为下一步研究中药对肝功能受损的保护性研究提供基础支持，为生活在寒区低温冷刺激环境下的人民生活保障提供更好的理论支持。

参考文献

[1]石裕明.肿瘤坏死因子介导肝细胞凋亡的研究进展[J].国外医学(流行病学传染病学分册),1996,(06):266-270.

[2]卢明芹,许烂漫,陈永平,等. 内毒素耐受对D-GalN/LPS致大鼠肝损伤保护[J].中国公共卫生,2008,24(12):1493-1494.