免疫荧光染色与传统抗酸染色在肺结核病理诊断中的应用分析

辜正策,李璐池,邓小婧,刘晓未

（眉山市中医医院  四川眉山 620010）

摘要：背景：肺结核是一种由结核分枝杆菌感染引起的呼吸系统传染病，发病率和死亡率均居于传染类疾病第二位。目前对于肺结核的病理诊断方法主要有传统的抗酸染色和新兴的免疫荧光染色，不同的方法各有其优缺点。目的：探讨免疫荧光染色与传统抗酸染色在肺结核病理诊断中的应用价值，得出最适合于病理实验室的抗酸杆菌检测方法。方法：收集2021年8月至2022年8月在眉山市中医医院就诊时临床怀疑为肺结核的病人进行肺穿刺且组织学诊断为肉芽肿性炎伴干酪样坏死的组织学标本183例，每例由科室技术老师按标准操作制作两张切片后分别进行传统抗酸染色和免疫荧光染色，比较两种方法的镜检表现和阳性检出率。结果：结核分支杆菌在免疫荧光染色法时镜检更清晰，阳性检出率更高。

关键词：肺结核；免疫荧光染色；抗酸染色；病理诊断

结核病已经成为我国重大的传染病之一，是严重危害人类健康的呼吸道传播疾病。据WHO的数据统计报告,我国不仅仅是世界范围内22个结核病流行最严重国家之一，同时也是27个耐结核病药物流行严重的国家之一。目前,我国结核病的年发病人数高达130万，约占全球发病人数的14.3%，位居全球的第二位。因此，结核病已经成为我国危害人们健康最严重的呼吸道传染病[1]。因此积极诊治肺结核，预防其传播和流行具有重大意义，而准确的诊断肺结核是临床进行有效抗结核治疗的基础和前提。在病理诊断中，肺结核的确诊依靠肺组织学标本进行抗酸染色找到确切结核分枝杆菌,但其阳性率低，易漏诊误诊,目前科室新开展了免疫荧光染色来辅助诊断抗酸杆菌，我们有必要进行相关的对比实验,分析两种方法的优缺点,找到最佳实验方法，提高抗酸分枝杆菌检出率及病理诊断的准确率,指导临床合理用药和精准治疗,争取消除肺结核,保障广大人民群的生活质量。

1 资料与方法

  1.1一般资料  参与研究的对象为2021年8月至2022年8月眉山市中医医院就诊时临床怀疑为肺结核的病人进行肺穿刺且组织学诊断为肉芽肿性炎伴干酪样坏死的组织学标本183例。注：肺其他非结核性病变的穿刺标本不作为研究对象；组织学诊断为肺单纯炎性病变的标本不作为研究对象；其他部位的结核性病变组织学标本不作为研究对象。入组患者男性83例，女性100例，年龄23～76岁，平均(55±6)岁。研究方案经医院伦理委员会审核批准，患者及其家属签署知情同意书。

  1.2实验方法  由技术老师将183例组织学标本每例制作两张切片，分别分为A组（传统抗酸染色组）和B组（免疫荧光染色组）进行实验，比较两种方法的镜检表现和阳性检出率。

A、传统抗酸染色组：

     试剂选择：贝索公司的病理抗酸染色液，主要成分为石炭酸复红溶液（主要成分碱性品红、苯酚）,酸性酒精溶液（主要成分乙醇、盐酸），亚甲基蓝溶液（主要成分亚甲蓝）。

     具体操作：所选的肺石蜡包埋组织切片，厚度为3μm，一张玻片上切两张切片。To透明剂（主要成分二甲苯）脱蜡3次，每次5 min, 依次经无水乙醇，95%酒精，85%酒精每缸2 min脱透明剂，蒸馏水冲洗2 min。滴加石炭酸复红染液染色，注意染液覆盖所有组织，时间为15min，蒸馏水冲洗，加酸性酒精脱色2-3次，每次约2min，直至切片无色或部分组织呈淡红色。亚甲基蓝溶液复染30s,蒸馏水冲洗2 min，常规脱水、晾干、封片。普通光学显微镜镜下阅片,先20X目镜进行观察,再用40X的目镜进行确认。

   B、免疫荧光染色组：

      试剂选择：济南得亨医学科技有限公司的免疫显色剂（V），主要成分为A液（荧光素、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、纯化水）和B液（复染剂）。

      具体操作：所选的肺石蜡包埋组织切片，厚度为3μm，一张玻片上切两张切片。To透明剂（主要成分二甲苯）脱蜡3次，每次5 min, 依次经无水乙醇，95%酒精，85%酒精每缸2 min脱透明剂，蒸馏水冲洗2 min。，甩干水分。直接向样本上滴荧光染色液A液（只需一滴直接染色），染液以覆盖整个样本为准，室温染色15 min，流水洗。5%盐酸酒精脱色脱色洗直到肉眼观察无色为止。滴加B试剂一滴染1-3s，流水冲洗。荧光显微镜下（UV波段）观察，首先以10X，20X目镜进行观察，发现疑为抗酸杆菌的荧光物质，再以40X目镜进行确认。

1.3 结果判读  传统抗酸染色组和免疫荧光染色组的每张切片均由2名医师分别阅片，且保证所有视野全部阅到，保证结果客观准确。

   A、传统抗酸染色组：抗酸杆菌呈鲜红色，形态为弯曲小杆菌，退变可呈小点状，背景为淡蓝色。

    B、免疫荧光染色组：抗酸杆菌呈亮黄色，形态为弯曲小杆菌，背景为蓝色。

注：结果判读只认阳性率，阳性程度不作为比较标准。

1.4数据处理  应用SPSS 18.00软件进行统计学分析。计数资料以例数和百分比表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

                         不同染色方法镜检表现

检测方法	背景	菌体形态	菌体颜色	镜检时间
A组（传统抗酸染色组）	偏暗、干扰多	弯曲小杆菌，易蜕变	鲜红色	长
B组（免疫荧光染色组）	亮、清晰蓝色	弯曲小杆菌	亮黄色	短

                   不同染色方法结核杆菌阳性检出率比较

检测方法	结核阴性（例）	结核阳性（例）	阳性率
A组（传统抗酸染色组）	130	53	28.96%
B组（免疫荧光染色组）	108	75	40.98%

综上，免疫荧光染色法镜检表现更优，结核分枝杆菌检出率也更高，更适于病理实验室开展。

3讨论

肺结核是由感染结核分枝杆菌引起的一种慢性、传染性疾病，结核杆菌会入侵机体肺部、肝部、胃部、肠部等各个器官组织，其中最为常见的为肺结核。临床数据显示，近年来临床肺结核发病率表现出明显升高趋势，青年人为高发群体，有4～8周的潜伏期，随着病程进展，还会累及肠、脑膜、皮肤等。肺结核表现为慢性过程，多数存在咳嗽、低热、乏力、呼吸系统等症状，但不同肺结核其临床症状存在一定差异[2]。肺结核患者一旦治疗不及时，将对机体各个器官组织造成严重损伤，进而危及生命。因此，临床需及早发现、诊断疾病，及时开展治疗，对提高疾病预后具有积极的作用[3]。在病理科目前结核分支杆菌的检测方法主要是组织学加抗酸染色，组织学上结核病病理形态学主要表现为肉芽肿性炎伴干酪样坏死,外周由上皮样细胞、朗格汉斯巨细胞、反应性增生纤维母细胞及淋巴细胞构成，而抗酸染色是检测结核分枝杆菌的传统方法,可用于痰涂片和组织切片染色,其方法简单、成本低、特异性高,但是灵敏度低,易造成假阴性[4]。我科室目前开展的免疫荧光染色法在镜检表现和阳性率等方面均优于传统的抗酸染色，可以在病理实验室推广，能有效提高阳性率，避免病人做过多不必要的检查，精准医疗减少病人的身心痛苦和经济压力。同时也可以降低肺结核的传染性和社会危害性，减轻社会经济负担。

[1]杨江华,朱晓玥,王文节.免疫荧光染色法检测结核分支杆菌的建立与临床应用[J].中国实验诊断学,2015,19(05):775-777.

[2]刘海燕,李曦,孙纪英,邓彬.Xpert MTB/RIF在儿童肺结核肺泡灌洗液检测中的应用[J].现代临床医学,2020,46(05):327-330.

[3]李幸旻."结核分枝杆菌/利福平耐药性实时荧光PCR检测与抗酸染色在肺结核中的诊断价值." 中国当代医药 29.14(2022):146-149.

[4]赵杰,刘影,郑细闰,李楚天,郑广娟.商品化抗酸染液在石蜡病理切片中的应用[J].诊断病理学杂志,2018,25(08):589-590.