槲皮素对肝癌细胞增殖及凋亡影响的研究

秦天卓,马宁波,梁光梅,刘政

锦州医科大学食品与健康学院 辽宁 锦州 121001

摘要：本文以人肝癌细胞HepG-2为研究对象，探讨槲皮素对肝癌细胞增殖及凋亡的影响。应用酶标仪、激光共聚焦显微镜及流式细胞仪，进行细胞毒性及形态学分析，凋亡率、细胞周期及线粒体膜电位检测，胞内钙离子稳态分析。细胞增殖受到抑制、呈现典型的凋亡形态学变化，细胞线粒体膜电位降低，细胞内钙离子浓度增大，胞内钙离子稳态被打破。槲皮素可通过阻滞细胞周期进程，降低线粒体膜电位，打破细胞内钙离子稳态来诱导肝癌细胞 HepG-2 凋亡。 

关键词：槲皮素；肝癌细胞；增殖；细胞凋亡

槲皮素在自然界中广泛分布于中草药或其他植物的叶、花、果实中，具有抗氧化、抗炎、抗病毒、降糖、降压及抗肿瘤等作用。槲皮素是一种天然的黄酮类化合物，它对胃癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌等多种肿瘤均具有增殖抑制作用，可诱导肿瘤细胞凋亡[1]。本文主要探讨槲皮素对肝癌细胞HepG-2增殖及凋亡的影响，为槲皮素开发治疗肝癌药物提供实验依据。

1材料与方法

1.1主要试剂、药物及仪器

槲皮素（纯度≥99%）购于成都曼思特生物科技有限公司；人肝癌 HepG-2 细胞株购于中科院细胞库；胎牛血清和DMEM 高糖培养基购于 GIBCO 公司；试剂盒、探针购于 BD 公司；Fluo-3/AM购于 Invitrogen公司；甲基噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜 (DMSO)、碘化丙啶 (PI) 购于美国 Sigma公司；二氧化碳培养箱(Binder)；倒置荧光显微镜(Olympus)；酶标仪(Flash闪谱)；流式细胞仪(Beckman)。

1.2实验方法

1.2.1 细胞处理及药物配制 

HepG-2肝癌细胞使用 DMEM 培养基加10% 胎牛血清在5% CO2、37℃、饱和湿度下培养，细胞长到70%～80%时传代，用0.25%的胰蛋白酶消化，并按 1∶ 3的比例传代。取对数生长期细胞进行实验。

槲皮素先用DMSO溶解中，然后再溶于培养基（DMSO终浓度小于 0.5%）。取对数生长期细胞，分别换用含有4、8和16µM槲皮素的培养基培养。设对照组 （用DMSO处理，终浓度为0. 5%）。

1.2.2  MTT法测定槲皮素对HepG-2细胞生长的抑制作用

取180 µL细胞悬液接种于96孔培养板，细胞进入对数生长期时分别换用含有4、8和16µM槲皮素的培养基培养，设置对照组，每组设5个重复，作用时间分别为 12h、24h、36h、48h，然后每孔加入MTT 20 µL ( 5mg/mL，PBS溶解)，继续培养4 h，弃培养基。每孔加入200 µL DMSO，充分振荡，酶标仪于490 nm波长处检测吸光度OD值。

1.2.3流式细胞术检测HepG-2细胞周期和凋亡

收集处理组和对照组细胞，调整细胞浓度为5.0×105细胞/样品，细胞于70% 无水乙醇，4℃处理12 h。PBS洗涤2次，加入0. 5 mL PI染液，4℃避光孵育15 min，按照试剂盒说明书操作，上流式细胞仪检测细胞凋亡率并分析细胞周期。

1.2.4 线粒体膜电位检测

收集处理组和对照组的肝癌细胞，调整其细胞浓度为1. 0×106细胞/样品，加入0.5mL JC-1染色液，置于培养箱中避光孵育20min，用37℃预热的PBS洗涤，0.5mL PBS悬浮，上流式细胞仪检测。

1.2.5 细胞内钙离子浓度的测定

收集处理组和对照组肝癌细胞，调整细胞浓度为1.0×106细胞/mL。加入Fluo-3/Am，放置在培养箱避光孵育30min，期间振荡4次，设置阴性对照 (不加 Fluo-3/Am)。用无钙离子PBS漂洗2次，PBS重悬至0.5mL，上流式细胞仪检测。

2 结果

2.1槲皮素对HepG-2细胞增殖的抑制作用 

MTT结果显示，槲皮素作用HepG-2细胞12h、24h、36h、48h后，随着槲皮素浓度的增大其 OD490值随之减小，显示活细胞数量减少，即能明显抑制其生长，该抑制作用随时间延长而增加，呈现一定的剂量、时间依赖性。

2.2槲皮素对HepG-2细胞凋亡的影响

槲皮素处理24h后，低浓度处理组细胞出现空泡，胞体缩小；中浓度处理组细胞形态变地模糊不清，空泡及细胞碎片增多；高浓度处理组细胞间连接几乎消失，胞体缩小，细胞膜皱缩，细胞膜表面凹凸不平，细胞裂解成较小的碎片，出现细胞坏死。对照组细胞饱满、立体感好，排列紧密，边缘清晰，细胞折光度好。

流式细胞仪检测发现，槲皮素可明显促进HepG-2细胞凋亡，且随着药物浓度的增加，作用时间的延长，凋亡细胞逐渐增多，呈现浓度依赖性。随着槲皮素浓度的增大，处在G1期细胞的数量增多，S期细胞数量下降，G2期细胞数量下降，表明细胞经槲皮素处理后增殖停滞在G1期，DNA合成受阻，这种关系随着槲皮素剂量的增大而愈加明显，呈现剂量依赖性。检测结果显示，随着槲皮素作用时间的延长和浓度的增大，凋亡细胞逐渐增多，且呈现出时间依赖性和浓度依赖性。

2.3线粒体膜电位检测

流式细胞仪检测显示，经不同浓度槲皮素作用36h后HepG-2细胞的线粒体膜电位下降，与对照组比较差异极显著。

2.4细胞内游离钙离子测定

流式细胞仪检测显示，随槲皮素浓度增大，HepG-2细胞内游离钙离子浓度逐渐升高，与对照组比较差异极显著。

3 讨论

本研究结果显示，槲皮素体外对HepG-2细胞的生长有抑制作用，细胞抑制率呈浓度、时间依赖性，且细胞形态发生明显的改变。这与先前的研究结果相似，槲皮素可体外抑制多种癌细胞增殖，如胃癌、肺癌、人食管癌和白血病细胞。为以后开展槲皮素诱导肝癌细胞凋亡机理的研究提供了重要实验依据。

参考文献

[1] 卢创新，周云，薛飞，等. 槲皮素抑制肝癌HepG2细胞的增殖及促凋亡机制的研究[J]. 中华实用诊断与治疗杂志,2012,8(26):760-762.

[2] 张玉洁，吴倩，曹军华，等. 槲皮素对人肝癌SMMC_7721细胞增殖和凋亡及其凋亡通路的影响[J].中医药导报,2013,19(5):93-95.

通讯作者：刘政，女，汉族，实验师

课题名称：锦州医科大学大学生创新创业训练计划项目，编号171220901107。