高效液相色谱串联质谱法检测西地那非血浆浓度

郎潇

（南京西默思博检测技术有限公司，江苏南京 210000）

目的：建立高效液相色谱串联质谱法测定人血浆中西地那非的浓度。

方法：以西地那非-d8为内标，血浆经甲醇沉淀蛋白后，采用Titank-C18色谱柱分离，流速0.5 mL/min；以选择反应检测（SRM）方式进行检测。

结果：西地那非的线性范围为4.00ng/mL~1000 ng/mL，提取回收率和内标平均提取回收率分别为82.32%～84.75%和99.69%，日内和日间准确度精密度均＜15%。

结论：本法操作简便、快速、灵敏，重现性好，适应于西地那非人体内血药浓度的测定及其药代动力学和生物等效性研究。

关键词：西地那非；高效液相色谱串联质谱法；含量测定

西地那非是一种5型磷酸二酯酶（PDE5）抑制剂，PDE5在阴茎海绵体中高度表达。当性刺激引起局部一氧化氮（NO）释放时，一氧化氮激活鸟苷酸环化酶，导致环磷酸鸟苷（cGMP）水平增高，使海绵体平滑肌松弛，血液流入而使阴茎勃起。西地那非对人海绵体无直接松弛作用，通过选择性抑制PDE5，升高环磷酸鸟苷（cGMP）水平高而导致阴茎海绵体平滑肌松弛，从而对阴茎血流水平进行调控。西地那非临床上用于治疗勃起功能障碍（ED），能安全有效的改善各种ED患者的勃起功能[1]。

西地那非口服后吸收迅速，10～40min起效，绝对生物利用度约为40%。空腹口服30～120min后达血药浓度峰值（Cmax），餐后口服90～180min达Cmax。

本文建立HPLC-MS/MS法测定人血浆中西地那非的浓度，采用甲醇蛋白沉淀法，简单，快速，稳定，可同时满足临床药代动力学及生物等效性研究中大批量样品分析的要求。

1. 仪器与对照品

Thermo TSQ Altis 三重四级杆质谱仪；Vanquish UHPLC超高效液相。枸橼酸西地那非来源：中国食品药品检定研究院，批号：420012-202003；西地那非-d8来源：TLC，批号：1390-029A2。

2. 方法
   1. 液相色谱-质谱条件
      1. 色谱条件：色谱柱为Titank C18 5μm 50x2.1mm；流动相5mM乙酸铵溶液（A）和乙腈溶液（B）；流速0.5mL/min；梯度洗脱程序为0minA：B（80:20）→2.5minA：B（90:10）→3.4minA：B（90:10）→3.5minA：B（80:20）→3.5min A：B（80:20）(stop)，0.8min质谱切入，3min质谱切出；柱温35℃；进样量2L。
      2. 质谱条件：ESI（电喷雾离子源），正离子检测模式，其中离子化电压3500V，鞘气60Arb，辅助气15Arb，尾吹气2Arb，离子传输管温度380℃，蒸发器温度350℃，选择反应检查（SRM）方式定量，西地那非m/z 475.30→283.19，西地那非-d8m/z 483.37→283.19。
   2. 溶液的配制
      1. 对照品溶液：精密称取枸橼酸西地那非对照品，用适量的甲醇溶解，配制成浓度为1mg/mL的储备液（使用校正因子），再使用甲醇将西地那非配置成为200ng/mL（LLOQ水平）、400 ng/mL、1000 ng/mL、4000 ng/mL、12500 ng/mL、30000 ng/mL、45000 ng/mL、50000 ng/mL的工作溶液，以及浓度为定量下限（LLOQ，200 ng/mL），低浓度（LQC，600 ng/mL），几何中浓度（GMQC，3000ng/mL），中浓度（MQC，25000 ng/mL），高浓度（HQC，40000 ng/mL）的质控溶液。
      2. 内标溶液：将西地那非-d8对照品用适量的甲醇溶解，配制成浓度为4mg/mL的内标溶液（使用校正因子）。移取200μL该溶液加入至600μL甲醇中，配制成浓度为1.00 mg/mL的内标储备液储备液。使用适量的甲醇将内标储备液稀释至20.0 g/mL作为内标工作溶液。
   3. 样品前处理：移取100 μL血浆样品（空白样品和内标空白样品加 100μL空白血浆），加入10.0μL IS-C（西地那非-d8 500 ng/mL）溶液（空白样品加入10.0μL甲醇溶液）。分别加入390 μL的0.5%氨水甲醇溶液，将样品涡旋 5分钟后，在 4000 rpm、4°C 条件下离心5分钟，用移液工作站移取上清液150μL，使用150μL的含0.5%氨水[甲醇：水（1：3）]溶液稀释，涡旋 5 分钟，在 4000 rpm、4°C条件下离心5分钟，交由 LC-MS/MS 分析。
   4. 标准曲线和线性范围：取空白血浆490 μL，加入10.0 μL的西地那非工作溶液，得到浓度为4.00 ng/mL、8.00 ng/mL、20.0 ng/mL、80.0ng/mL、250 ng/mL、600 ng/mL、900 ng/mL、1000 ng/mL的血浆样品，按照前处理方法进行提取。对理论浓度与响应值（待测物与内标峰面积比值）进行线性回归，采用最小二乘法对标准曲线所有浓度点进行拟合，权重因子为1/x2，其在整个方法验证中须保持一致。
   5. 准确度与精密度：取空白血浆490 μL，加入10.0 μL的西地那非质控溶液，得到浓度为4.00ng/mL（LLOQ）、12.0ng/m（LQC）、60.0ng/mL（GMQC）、500ng/mL（MQC）、800ng/mL（HQC）的质控血浆样品，按照前处理方法进行提取。在3批连续独立的验证分析批考察质控样品（包括LLOQ、LQC、GMQC、MQC和HQC 5个浓度水平，每浓度水平 6 个重复样品，至少分两天进行），评估批间的准确度和精密度。
   6. 选择性：空白基质对待测物与内标的干扰：通过测试6个不同来源（批次）的不添加待测物和内标的空白基质样品（各1个重复）进行评估；待测物对内标的干扰：通过测试混合空白生物基质中只添加待测物（不添加内标）的定量上限（ULOQ）浓度水平的样品进行评估（1个重复）；内标对待测物的干扰通过测试6个不同来源（批次）的空白基质中只添加内标（内标浓度为常规样品中内标浓度水平）不添加待测物的样品（各1个重复）、1 个混合基质内标空白样品进行评估。
   7. 基质效应：使用至少6 个不同来源的单个空白基质来考察内标及待测物低、高浓度水平下（LQC、HQC）的基质效应。
   8. 溶血效应：使用4个不同来源的单个空白基质配制溶血质控样品来考察溶血在低、高浓度水平下（LQC、HQC）对待测物检测结果的影响。
   9. 高脂效应：使用至少 4 个不同来源的高脂血浆配制高脂质控样品来考察高脂在低、高浓度水平下（LQC、HQC）对待测物检测结果的影响。
   10. 提取回收率：6 个重复的LQC、MQC、HQC与18个混合空白生物基质样品一同处理。处理后，将含有待测物和内标的溶液加入空白样品中，以使其最终浓度与高、中、低质控样品的进样浓度一致。
   11. 残留：在定量上限样品之后进样分析空白基质样品，评估系统残留。空白样品中待测物/内标的峰面积均值应不超过该分析批有效定量下限标准曲线样品峰面积响应均值的20.0%（对于待测物），5.0%（对于内标）。
   12. 稳定性试验：考察了西地那非储备液与定量下限在室温黄光条件下20小时的溶液稳定；低、高浓度质控血浆样品在黄光冰浴条件下18小时的短期稳定性；低、高浓度质控血浆样品在-20°C和-80°C条件下的4次冻融稳定性与放置41天的长期稳定性；人全血高、低浓度质控样品在黄光冰浴下放置2小时后的稳定性；4℃避光条件下放置68小时的制备后样品稳定性。
3. 结果与讨论

色谱图由 Chromeleon(c) Dionex 软件 7.2.6 版自动采集。用分析物和内标的峰面积比和标准样品的浓度来建立标准曲线，得到线性回归方程（使用加权最小二乘法，权重因子 1/x2），软件自动计算浓度。

西地那非的定量范围为4~1000 ng/mL，满足方法验证的相关接受标准，批间准确度偏差在-4.53%和3.26%之间，批间精密度在2.06%和3.60%之间。质控样品批内准确度偏差在-3.89% 到2.13% 之间，批内精密度在1.12% 到4.96% 之间，批间准确度偏差在-2.20% 到-0.89% 之间，批间精密度在2.25% 到4.04% 之间。西地那非的准确度和精密度均满足相应接受标准[2]。

不同来源的基质西地那非的测定不存在干扰，且西地那非以及内标之间也不存在相互干扰，人血浆中西地那非和内标化合物的测定不受生物基质的影响；本方法未见显著进样残留。西地那非高、中、低 3 个浓度质控样品的平均提取回收率为84.75%、83.52%、82.32%，内标平均提取回收率为99.69%，表明在本方法的定量范围内西地那非和N-去甲基西地那非具有足够、相对均一的提取回收率且内标具有较高的回收率。

提取后溶血、高脂样品的准确度的真实值在 ±15%之内，精密度 %CV ≤15%，且至少 50% 的溶血质控样品测定值与理论值的偏差（%RE）不超过±15.0%，均满足相应的接受标准，表明人血浆溶血现象对西地那非血浆样品真实浓度测定无影响。

西地那非的溶液与血浆在相关条件下均保持稳定。

4. 小结

本研究对测定人血浆中西地那非的 LC‑MS/MS 法进行了全面方法验证。经验证的西地那非的定量范围为 4.00 ng/mL ~ 1000 ng/mL。方法验证结果证明了本方法对于测定人血浆中西地那非浓度的可靠性。此方法的选择性、准确度、精密度、基质效应、制备后样品稳定性、定量下限、稀释可靠性、生物基质和储备液在储存和处理过程中的稳定性、溶血和高脂稳定性以及全血稳定性等均满足接受标准。

参考文献

[1] 万艾可®说明书

[2] 2020版中国药典四部 9012，生物样品定量分析方法验证指导原则