性别差异对于天花粉中蛋白质含量差异的研究

陈旭 ,朱述英

 山东协和学院  山东济南    250109

摘要：目的  通过对比雌雄栝楼根所制成的蛋白质含量差异，探讨雄植株对于天花粉质量的影响。方法  利用丙酮分级沉淀法提取蛋白质，用回归分析法来进行数据上的处理。结果 雌雄天花粉中天花粉蛋白的含量分别为0.213%、0.328%。结论 雄性植株显著高于雌性植株。

关键词：天花粉；栝楼；雌雄植株；蛋白质

天花粉是葫芦科植物栝楼Trichosanthes kirilowii Maxim.或双边栝楼Trichosanthes kirilowii Harms的干燥根茎,是一种常见的中草药,具有清热泻火、生津止渴、消炎排脓的作用,主治热病烦渴、肺热燥咳、内热消渴篇、疮疡肿毒[1]。

天花粉在近年的研究中已被证实其主要发挥药理作用的成分为天花粉蛋白、天花粉多糖等，目前国内对于天花粉质量鉴别研究技术较为成熟，在2020年版《中国药典》[1]四部中，对于天花粉质量鉴别也进行了完善。本文就可溶性蛋白进行测定来判断性别对于天花粉质量的影响。

一、实验对象及方法

植株为济南长清区栝楼种植园所购买的雌、雄植株栝楼根，经山东协和学院中药鉴定教研室鉴定为葫芦科植物栝楼（Trichosanthes kirilowii Maxim.）的根。

（一）使用丙酮分级法提取天花粉蛋白

取事先准备好的雌、雄植株栝楼根用粉碎机制成的天花粉末各5.0g，然后向粉末中加入盐酸（2mol/L）并将溶液的pH调节至4.0左右，再加入原溶液体积80%的丙酮溶液，放入温度设置为5℃，转速5000r/min，且对称放入相似质量的溶液到离心机中进行离心，20min后再取上清液，再向溶液中加入原体积50%量的丙酮，以同样条件进行离心沉淀，上清液移入50mL容量瓶，定容，作为供试品备用[2]。

（二）蛋白质标准曲线的绘制

精密量取0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL的天花粉蛋白质供试品，以0.1mol/L PH6.8的磷酸磷酸缓冲液稀释，以考马斯亮蓝G-250蛋白试剂显色，在595nm下，用紫外-分光光度计观测并测量吸收率A的数值。将蛋白的浓度作为横坐标，吸收系数A作为纵坐标得到的回归方程：Y=6.0215X+0.0498（r=0.9976）

（三）蛋白质稳定性实验

精密量取蛋白质供试品溶液5mL，采用同样条件，分别放置1h，2h，3h，4h，测定吸光度值，通过计算可得出RSD为1.32%。

（四）蛋白质回收率试验

精密量取天花粉蛋白质的供试品1ml，重复量取6份，将牛血清白蛋白用移液器精确地吸入，然后加入0.6毫升、0.6毫升、0.8毫升、0.8毫升、1.0毫升、加水稀释，直至50毫升容积的瓶子中，将每一种溶液精密地吸入，并将它们分别装于10毫升的瓶子中。精密吸取上述各溶液，定容后以同样方法测定吸光度值。另用2mL的蒸馏水，作为实验空白对照组使用。测定最终结果。平均回收率为96.97%，其中RSD为2.37%（n=6）

二、实验结果

雄性植株天花粉蛋白质的含量为0.328%，雌性植株天花粉蛋白质的含量为0.213%，雄性植株天花粉蛋白质的含量明显高于雌性植株天花粉蛋白质，且雄性植株天花粉蛋白质的含量是雌性植株天花粉蛋白质含量的约1.54倍。雌雄植株天花粉蛋白含量通过重复性试验、稳定性试验以及回收率试验的结果验证了含量测定结果的可靠性。

三、讨论及展望

天花粉蛋白质主要有终止妊娠的功效[3]，常用于早起妊娠、中期妊娠、哺乳期妊娠、终止妊娠的患者使用，也有抗病毒、抗肿瘤以及医治艾滋病的作用[4-5]。天花粉多糖的主要药理学作用为降血糖，更是有研究表明天花粉多糖有促人外周血单个核细胞增值作用以及阻碍人子宫颈癌细胞生长的作用[6]。栝楼植株碳素营养状况的重要指标之一便是天花粉多糖，植株的碳素代谢状况会根据天花粉多糖的含量的变化而变化。植株氮素同化的水平也随着天花粉蛋白质的含量变化而变化。雌性植株的天花粉蛋白质在含量上的差异，即雄性植株显著高于雌性植株的结果也说明了基于性别差异的天花粉植株在碳素代谢和氮素同化等方面也有着一定的差异，对于未来天花粉的进一步研究有着一定的参考意义。

现如今天花粉质量鉴别的方法较多，但随着研究的深入，天花粉质量鉴别的方法也越来越精确。对于天花粉可溶性蛋白质的测定，本实验将采用考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue，后用CBB代替）G250染色法。这一方法的实质为：CBBG-250溶液在不与蛋白质融合时，即在游离状态下，呈红色，并且在紫外检测仪可以看到488纳米处的最大光吸收。当CBBG-250试剂加入到蛋白质溶液中，并与蛋白质融合时，可以形成CBB-蛋白质有机结合体，所形成的有机结合体可以在在595纳米波长下观察到最大光吸收，并且其光吸收值A与蛋白质的含量关系可采用回归方程来清晰地表达，即呈现出正比关系。本实验将采用Mirechi和Teramura的方法

[1]来测定紫外吸收物的含量。雌雄天花粉蛋白水分灰分的检测完全按照2020版《中国药典》一部中的方法进行检测，按照药典中的要求，天花粉检查的含水量不得大于百分之十五，总灰分不得大于百分之五[1]。将雌雄栝楼植株制成的天花粉分别用上述的方法进行质量鉴别，分别计算雌雄天花粉内含物含量的百分比。为了确保数据的准确性和去除实验偶然因素，实验将对每个含量测定实验的重复性、稳定性、回收率也进行试验，得出符合预期的RSD（%），确保实验结果的可信度和数据的准确性。雌雄植株天花粉的实验数据将回归方程的方式进行分析，可直观的看出雌雄植株天花粉各检测成分的含量差异。

经实验和结果表明，不同性别天花粉主要鉴别的有效物成分有明显的差异，即雄性有效物质含量高于雌性。通过实验结果数据图表可以清晰的看出雌雄异株植物栝楼因性别不同导致其药用部位内含物也有着明显差异，因此我们在对所有雌雄异株的中药材植株进行质量鉴别时都应该考虑性别差异的影响，在用药时采用雌雄合理比例进行入药。

参考文献：

[1]国家药典委员会.中国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2020:1088.

[2]Mishra NP, Mishra RK, Singhal GS. Changes in the Activities of Anti-Oxidant Enzymes during Exposure of Intact Wheat Leaves to Strong Visible Light at Different Temperatures in the Presence of Protein Synthesis Inhibitors. Plant PHysiol. 1993 Jul;102(3):903-910. doi: 10.1104/pp.102.3.903. PMID: 12231875; PMCID: PMC158862.

[3]刘海萍，巢志茂，谭志高,等．雌雄异株药用植物的物质基础分析及 其研究技术［J］． 中国中医药信息杂志，2012，19( 4) : 104-107

[4]李珊,程舟,李彦,等.雌雄栝楼植株内含物比较研究[J]. 中草药,2008(02):260-263.

[5]黄晓兰,吴惠勤,王蔚,等.天花粉多糖的提取、分离与纯化研究[J].中草药,2008,39(11):1662-1665.

[6]曲春香,沈颂东,王雪峰,等. 用考马斯亮蓝测定植物粗提液中可溶性蛋白质含量方法的研究[J]. 苏州大学学报(自然科学版),2006(02):82-85

作者简介：朱述英，女，汉族，山东滕州，1983年3月，硕士，副教授，中药药理学。

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