硫酸吗啡原料药中有关物质检查方法研究

郭满1  ,耿艳丽2

凯莱英生命科学技术（天津）有限公司     天津市300450   天津市正方科技发展有限公司  天津市 300270

摘要:目的 通过对硫酸吗啡原料药的有关物质进行分析,考察现行标准的完善性,探讨存在的问题,为提高产品质量标准提供参考｡方法 采用HPLC,选用SymmetryC18(4.6mm×150mm,5μm)色谱柱,以1.01g·L-1庚烷磺酸钠溶液(用50%磷酸调节pH值至2.6)和甲醇为流动相进行梯度洗脱;检测波长为230nm,流速为1.5mL·min-1,柱温35℃｡结果 国内硫酸吗啡原料药中检出的主要杂质有可待因(杂质A)､伪吗啡(杂质B)､10-羟基吗啡(杂质D)､吗啡酮(杂质E)和吗啡氮氧化物(杂质F),溶液稳定性显示其中伪吗啡含量增加明显,表明样品需临用新配｡结论 建立方法的专属性､线性等均良好,能用于硫酸吗啡原料药中有关物质的检测｡现行标准中缺少有关物质检查项,建议增加｡

关键词:硫酸吗啡;有关物质;高效液相色谱法;伪吗啡;吗啡酮

硫酸吗啡是常用的阿片类药物,用于治疗急性和慢性最有效的镇痛药类别之一,是由吗啡成盐后的一种形式,为阿片类受体激动剂,是临床常用的麻醉药品,具有强效镇痛作用,适用于其他镇痛药无效的急性剧痛｡除此之外,还具有镇静､呼吸抑制､镇咳､抗癌､抗抑郁等多种药理作用｡

1仪器与试药

1.1仪器

岛津LC-2030C3D型高效液相色谱仪(二极管阵列检测器;岛津公司)､Waterse2695型高效液相色谱仪(二极管阵列检测器;Waters公司),SartoriusBS224S型万分之一､CP225D型十万分之一电子天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司),KQ-500DE型数控超声仪(昆山市超声仪器有限公司)｡

1.2对照品

吗啡杂质A对照品(批号:170317,含量:94.2%)､吗啡杂质B对照品(批号:170720,含量:97.9%)､吗啡杂质C对照品(批号:170718,含量:95.1%)､吗啡杂质D对照品(批号:170914,含量:95.9%)､吗啡杂质E对照品(批号:170520,含量:92.3%)､吗啡杂质F对照品(批号:170523,含量:94.3%)､吗啡对照品(批号:171201-201324,含量:99.1%)､硫酸吗啡对照品(批号:171238-201708,含量:87.3%)｡

1.3试剂

庚烷磺酸钠(Merck公司);甲醇(色谱纯);磷酸､醋酸(分析纯)｡

1.4样品

硫酸吗啡原料药(批号:20180303､20151104､20151001,A药厂)｡

2方法与结果

2.1色谱条件

参照EP9.0和BP2018拟定的有关物质检查方法进行研究:采用SymmetryC18(4.6mm×150mm,5μm);流动相A:1.01g·L-1庚烷磺酸钠溶液(用50%磷酸调节pH值至2.6);流动相B:甲醇,梯度洗脱(梯度洗脱程序见表1);检测波长为230nm,流速1.5mL·min-1,柱温35℃,进样量10μL｡

2.2系统适用性､供试品和对照溶液制备方法

系统适用性溶液:精密称取吗啡杂质A､B､C､D､E､F对照品､吗啡对照品､硫酸吗啡对照品,分别置于10mL量瓶中,用1%乙酸溶解并稀释至刻度,制成每1mL中约含吗啡､硫酸吗啡及各吗啡杂质1mg的储备液｡量取吗啡及各吗啡杂质适量,用1%乙酸溶液稀释制成每1mL中约含杂质A､B､C､D､E､F各10μg､吗啡50μg的溶液,作为系统适用性溶液｡供试品溶液:取本品约125mg,精密称定,置50mL量瓶中,加入1%乙酸约30mL,超声使溶解,用溶剂稀释至刻度,摇匀､滤过,取续滤液作为供试品溶液｡

对照溶液精密量取供试品溶液1mL,置100mL量瓶中,用1%醋酸溶液溶解并稀释至刻度,摇匀,再精密量取1mL,置5mL量瓶中,用1%醋酸溶液溶解并稀释至刻度,摇匀,作为对照溶液｡

2.3方法验证

2.3.1专属性试验

取1%乙酸､系统适应性溶液各10μL,注入液相色谱仪,记录色谱图｡系统适应性溶液中各色谱峰之间的分离度最小为1.9,空白溶剂不干扰检测,色谱图见图1｡

图 1 硫酸吗啡有关物质检测系统适应性溶液专属性色谱图

2.3.2线性与范围

分别精密吸取“2.2”项下硫酸吗啡和各吗啡杂质对照品储备液,制成系列对照品溶液,分别注入液相色谱仪,测定峰面积｡以峰面积为纵坐标(Y),各对照品质量浓度为横坐标(X),绘制标准曲线｡通过计算硫酸吗啡的响应值与已知杂质的响应值之间的比值,得到各已知杂质的校正因子｡结果表明,硫酸吗啡以及各杂质在各自的线性范围内线性关系良好｡杂质D的校正因子计算约为0.9,根据《中国药典分析检测技术指南》规定,校正因子在0.9~1.1之间,则可视为1,因此杂质D的校正因子最终定为1｡

2.3.3系统精密度试验

精密吸取系统适应性溶液10μL,连续进样6次,记录峰面积,吗啡及杂质A､B､C､D､E､F的峰面积相对标准偏差(RSD)分别为0.2%､0.3%､0.08%､0.09%､0.7%､0.3%和0.2%,均小于2.0%,说明该系统的精密度良好｡

表1硫酸吗啡有关物质梯度洗脱条件

2.3.4中间精密度试验

取硫酸吗啡原料药(批号:20180303),由两名分析人员在不同日期分别平行配置6份供试品溶液,按照“2.1”项下色谱条件,使用不同的仪器进行测定,杂质A､B､D､E､F共12次测定的含量RSD分别为3.1%､4.0%､2.8%､1.3%､3.9%,均小于8%,表明方法的中间精密度良好｡

2.3.5准确度试验

精密称取杂质A､B､C､D､E､F和硫酸吗啡适量,用1%乙酸溶解并定量稀释,制成每1mL中约含1mg的溶液,作为各自母液｡再精密量取杂质A､C､D､F母液各0.4､0.5､0.6mL和杂质B､E母液各0.8､1.0､1.2mL分别置3个100mL量瓶中,用1%乙酸定量稀释至刻度,制成3个水平的混合对照品溶液｡称取硫酸吗啡原料约62.5mg,置25mL量瓶中,一式9份,加入上述3个水平的混合对照品溶液超声溶解并定量稀释,每个水平平行3份｡精密量取10μL,注入液相色谱仪,记录色谱图,按外标法以峰面积分别计算杂质A､B､C､D､E､F的含量,并计算回收率,未知杂质用硫酸吗啡替代,单独配制,方法同杂质A｡参考Ch.P2020四部通则《9101分析方法验证指导原则》,各杂质回收率均在90%~108%之间,证实该方法具有良好的准确度｡

2.3.6强制降解试验

将硫酸吗啡原料药(批号:20180303)在酸､碱､氧化､高温､高湿､光照条件下进行强制破坏,了解其降解情况｡质量平衡,采用“公式1”计算单位浓度的响应值,以未破坏溶液的响应值为基数(物料回收为100%),计算破坏溶液的物料回收率,结果各破坏溶液的回收率在97.1%~100.1%之间,认为杂质检出情况良好｡

单位浓度的响应值=A总(校正后)/C(公式1)(A总-校正后的供试品溶液总峰面积,其中杂质E､B和F的峰面积分别乘以校正因子0.5､0.25､0.8加以校正;C-供试品溶液的浓度)硫酸吗啡原料药在高湿条件下较为稳定;在高温和光照条件下,会引起杂质B､D､E的升高;在酸性条件下,杂质B增加,杂质E降解;在碱性条件下,杂质B､D明显增大,并有2个新杂质增加;在氧化条件下,杂质A被降解了,杂质B､D､E､F明显增大,并产生许多新杂质｡在本色谱条件下,吗啡峰与相邻杂质峰分离度良好｡

3讨论

3.1检测波长的选择

采用二级管阵列检测器测定硫酸吗啡与各杂质,硫酸吗啡在285nm处有最大吸收,以285nm作为检测波长时,硫酸吗啡与各杂质的响应均较小,用230nm作为检测波长时,都有较好的响应,故确定有关物质测定波长为230nm｡

3.2色谱柱的选择

在方法摸索过程中,考察了3种不同的色谱柱:SymmetryC18(4.6mm×150mm,5μm)､X-bridgeC18(4.6mm×150mm,5μm)和SunfireC18(4.6mm×150mm,5μm),发现使用X-bridgeC18和SunfireC18两根色谱柱,杂质F与吗啡之间的分离度分别为0.5和0.8,均小于1.5,无法达到基线分离,说明吗啡与杂质F要实现很好地分离,对色谱柱有一定的选择性,故在色谱系统中推荐使用SymmetryC18色谱柱｡

3.3稳定性分析

通过对溶液稳定性的考察,发现杂质B随时间的推移,面积逐步增大,说明其不太稳定,也提示在检测有关物质时,样品需要临用新配｡本研究采用高效液相色谱法,以SymmetryC18(4.6mm×150mm,5μm)色谱柱为固定相,梯度洗脱,并用校正因子法对硫酸吗啡原料药中6个已知杂质进行测定,考察了多种质检方法等｡结果表明,本方法专属性好,对硫酸吗啡中的杂质检出度高,为修订和提高标准中的有关物质测定方法提供参考和依据｡

参考文献:

[1]Ch.P(2020)VolⅡ(中国药典2020年版.二部)[S].2020:1573.

[2]BP2018(2018)[S].2018:328-330.

[3]USP41-NF36(2018)[S].2018:2809-2810.