兔24小时房颤模型的时间依赖性ET-1变化研究

陈华1,郭祖秀2 ,张玲3,孙娟3,侯月梅4

1.自贡市第四人民医院心内科，四川省自贡市 643000；2.自贡市第一人民医院科研科，四川省自贡市 643000；3.新疆医科大学第一附属医院心律失常研究室，乌鲁木齐 830054；4.上海交通大学附属第六人民医院南院心内科，上海 201499

[摘要]目的：本研究将观察兔24小时心房颤动（AF）模型的内皮素-1（ET-1）的变化规律，初步探讨ET-1在预测AF发生、发展和指导临床治疗的价值。方法：新西兰兔40只，给予右心房快速起搏（600次/分）建立兔持续性AF模型。按起搏时间随机分成5组，0 h（P0）组、快速起搏4 h（P4）组，8 h（P8）组，12 h（P12）组，24 h（P24）组，每组8只。观察兔起搏后0、4、8、12、24 h的血浆及心房组织ET-1的变化规律。结果：兔血浆ET-1在起搏12h开始出现明显升高，至起搏24 h升至最高，心房肌组织ET-1主要分布在心房肌胞浆中， 在起搏12h开始升高,至起搏24 h显著升高。结论：AF持续12小时，仅有血浆ET-1水平显著升高，24小时AF时，血浆和心房组织ET-1水平才出现一致性升高改变。研究提示：血浆ET-1水平可能推测阵发性AF持续的时间，增高的心房肌组织ET-1可能是AF诱发AF的触发因素之一。

[关键词]心房颤动；快速心房起搏；内皮素1

心房颤动（Atrial Fibrillation, AF）是一种临床上常见的心律失常，具有多发、高致残、高病死率和疗效不佳的临床特征。近几十年来，随着人口老龄化，房颤的发病率呈逐年上升趋势。在房颤过程中，不仅存在心房电重构、结构重构及神经重构，还伴随着神经体液因子的重构，对神经体液因子的研究也是近年来房颤机制研究的另一个热点。内皮素-1(endothelin--1,ET-1)作为一种自分泌和旁分泌因子，具有促进细胞有丝分裂、加强心肌及平滑肌收缩等功能，可通过促进心肌肥大、心室扩张和心肌纤维化来促进心房重构过程[1]。一项荟萃研究结果显示，血浆ET-1可作为心力衰竭患者预后的生物标志物。另一项研究结果显示，血浆ET-1与稳定性冠心病患者病情严重程度密切相关[2]。然而，ET-1与心房颤动的研究相对较少，而ET-1在心房颤动中随时间变化的规律更是鲜见报道，因此本研究通过AF时血浆及心房组织ET-1的变化规律，探讨其作为生物学标记物，预测AF心房肌结构重构和神经重构价值，将为临床诠释AF维持的物质基础和指导治疗奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 动物及分组  成年新西兰兔40只，雌雄不拘，体重3.0±0.5 kg，据起搏时间分为5组，0h组（P0）、4h组（P4）、8h组（P8）、12h组（P12）、24h组（P24），每组8只。实验动物由新疆医科大学第一附属医院实验动物科学研究部提供，动物质量属于一级标准。

1.2 主要实验仪器 LEAD－2000电生理仪（四川锦江电子）、光学显微镜（日本奥林帕斯公司）、DF-4A型心脏电生理刺激仪（苏州中国东方电子仪器厂）、高清彩色病理图像系统（德国Motic Auto-Microscope System1.0）。

1.3 模型制作方法 按照杨尚磊等[3]建立的模型制作方法，所有大白兔实验前用3%戊巴比妥钠经兔耳缘静脉注射麻醉。在腔内心电图指引下经右颈内静脉置入一根4F两极电极至右心房测定心房起搏阈值，以心内电生理图出现大A 小V波为理想记录图，然后以脉宽1 ms，起搏电压为2倍起搏阈值（即2V）进行连续单刺激模式快速起搏，起搏频率为600次/分。AF定义为快速而不规则的心房激动，同时，心室呈不规则反应，R-R间期绝对不等，持续超过10 s。记录起搏诱发AF后血浆及右心房组织的ET-1的含量，起搏时间分别0 h、4 h、8 h、12 h、24 h。

1.4 血浆ET-1检测

在起搏停止后，用ELISA法分别测量AF 0 h、4 h、8 h、12 h、24 h血浆中ET-1含量。

1.5 兔心房组织免疫组化检测

在起搏停止后，将大白兔静脉注入3倍于标准麻醉剂量的3%戊巴比妥钠溶液，然用开胸迅速取出心脏，取其右心房组织于4%多聚甲醛溶液中固定，用免疫组化法检测右心房组织ET-1。

1.6 统计学处理  将资料的原始数据输入计算机建立数据库，采用SPSS19.0统计软件包进行数据描述和统计处理，计量资料中符合正态分布者用均数±标准差表示，均数间比较用重复测量资料的方差分析，两组间比较采用Dunnett t检验。 P < 0.05 为差异有统计学意义。

2 结  果

血浆及心房组织ET-1起搏时间依赖变化

    血浆ET-1含量在起搏12 h出现明显升高，在起搏24 h后升至最高，与起搏前比较，升高了96.68ng/L，差异有统计学意义（P<0.05）。与血浆ET-1比较，心房肌组织ET-1在起搏12 h开始逐渐升高，仅在起搏24小时升高达到统计学差异性。（见表1、图1、图2）

表1 起搏时间依赖性AF模型血浆及心房组织ET-1水平变化（±ｓ）

组别	P0	P4	P8	P12	P24
血浆ET-1（ng/L）	24.44±1.76	28.10±2.61	34.5±3.60	70.25±5.20*	121.12±10.17*
心房肌ET-1（µm2/mm2）	179.53±3.12	182.13±3.16	185.33±3.23	187.45±2.23	209.45±2.23*

*与0h组比较，P<0.05

 

*与0h组比较，P<0.05

图1不同时间点血浆ET-1的变化

*与0h组比较，P<0.05

图2不同时间点右心房组织ET-1的变化

3 讨  论

我们观察了起搏24小时兔AF模型时，血浆和右心房组织ET-1的变化，发现：（1）兔血浆ET-1基础含量为（24.44±1.76 ）ng/L，在起搏12h出现明显升高，至起搏24 h升高达（121.12±10.17 ）ng/L，（2）兔心房肌组织ET-1主要分布在心房肌胞浆中，基础含量为（179.53±3.12）µm2/mm2，在起搏12h开始逐渐升高，至起搏24小时升高到（209.45±2.23）µm2/mm2。我们发现，起搏24小时兔致AF模型中，血浆ET-1水平变化显著于心房肌组织ET-1变化，AF持续12小时，仅有血浆ET-1水平显著升高，24小时AF时，血浆和组织ET-1水平才出现一致性升高改变。

1988年，日本学者Yanagisaw首先从猪主动脉内皮细胞培养液中提取出了内皮素( Endothelin, ET)，此后的研究发现内皮素具有强大的收缩血管的功能，而且具有促进细胞增殖的作用，内皮素生物学活性非常广泛，大量研究表明，ET-1参与了心肌缺血、心力衰竭、高血压、脑卒中等许多疾病的发病过程[4]。

从人类第一次发现内皮素起，至今已有30余年时间，许多学者从不同多角度对其进行了深入的研究，人们已经对它的分子结构和主要生物学特点有了一定的认识，而且对其与心律失常的关系，也做了一定的研究，1989年，Ezra等报道，给予猪冠状动脉内注射ET-1可导致期前收缩、室性心动过速等心律失常，并且观察到，随着ET-1剂量的增加，心律失常的严重程度和死亡率也随之增加。2013年Abed 等[5]在对山羊心房组织ET-1研究时发现，随着山羊体重的增加，其心房 ET-1 及内皮素受体 ETA和 ETB表达增加，房颤发生的风险明显升高。在临床上也同样观察到内皮素与心律失常的关系密切。Nakazawa 等[6]研究发现，射频消融术前血浆 ET-1 表达水平是预测环肺静脉消融术后 3~6个月复发率的重要指标。Latini 等[7]也报道，房颤时血浆 ET-1 前体肽增加，是预测房颤复发的良好指标。洪玉杰等[8]的研究观察到ET-1 在房颤的发生中起着重要作用，其可能通过调控 PDGF-B 促进心房纤维化而导致房颤的发生。诸多研究表明，心房颤动导致了血浆ET-1水平的增加，并且不依赖于基础心脏病，血浆ET-1水平的升高是心房颤动的一个独立的预测因子。

同步观察起搏诱导AF兔模型的血浆及心房肌组织的ET-1水平变化，我们发现，起搏诱发AF持续12小时出现了血浆ET-1水平的显著变化，而心房肌组织ET-1表达不变，直到AF持续24小时才显著升高，因此，我们的研究提示，可以用血浆ET-1水平，推测阵发性AF持续的时间，AF持续12小时，血浆ET-1水平显著升高，持续24小时AF将出现心房肌组织水平ET-1分泌显著增加，此时心房肌组织的ET-1可能是AF诱发AF的触发因素之一。

参考文献

[1]Phosri S,Arieyawong A,Bunrukchai K,et al.Stimulation of adenosine A2B receptor inhibits endothelin-1-induced cardiac fibroblast proliferation and o-smooth muscle actin synthesis through the cAMP/Epac/PI3K/Akt-signaling pathway  [J].Front Pharmacol,2017,8:428.doi:10.3389/fphar.2017.00428.

[2]Chen J,Chen MH,Guo YL,et al.Plasma big endothelin-1 level and the severity of new-onset stable coronary artery disease [J]. Atheroscler Thromb,2015,22 (2):126-135.doi:10.5551/jat.26401.

[3]杨尚磊，周祁娜，等.阿托伐他汀对心房颤动预防作用及其电生理机制的实验研究[J].中华实用诊断与治疗，2012，26（5）：449-451.

[4] Zheng LH，Sun W，Yao Y，et al. Associations of big endothelin-1 and C-reactive protein in atrial fibrillation［J］. J Geriatr Cardiol，2016，13（5）：465-470. doi：10.11909/j.issn.1671-5411.2016.05.005.

[5]Abed HS, Samuel CS, Lau DH, et al. Obesity results in progressive atrial structural and electrical remodeling: implications for atrial fibrillation [J]. Heart Rhythm, 2013, 10: 90-100.

[6]Nakazawa Y, Ashihara T, Tsutamoto T, et al. Endothelin-1 as a predictor of atrial fibrillation recurrence after pulmonary vein isolation [J]. Heart Rhythm, 2009, 6: 725-730..

[7] Latini R, Masson S, Pirelli S, et al. Circulating cardiovascular biomarkers in recurrent atrial fibrillation: data from the GISSI-atrial fibrillation trial. J Intern Med, 2011, 269: 160-171.

[8]洪钰杰，钟国强，等.内皮素 -1 在心房颤动发生中的机制探讨[J].中国循环杂志 2016， 31（2）：146-150.