基于自组装铁蛋白纳米抗原颗粒及流感疫苗和制备方法

杨天波,李婷婷,邸卓

长春生物制品研究所有限责任公司，吉林省 长春市，130012

【摘要】近年来，铁蛋白（Ferritin）自组装纳米粒子在生物医学领域获得了较大推广。利用铁蛋白纳米粒子自组装、可修饰的特征，对流感病毒保守抗原HA2及M2e串联Ferritin基因进行探究，形成HA2．M2e．Ferritin基因插入装铁蛋白纳米抗原颗粒N端，将其按大肠杆菌密码子优化合成，扩增出铁蛋白基因，扩增至原核表达载体，重组质粒后将阳性质粒转入感受态细胞，诱导表达后获取最佳蛋白表达条件，鉴定得HA2．M2e．Ferritin及铁蛋白具有免疫反应，均可形成纳米结构，具有生物活性。

【关键词】自组装铁蛋白；抗原颗粒；流感疫苗

【中图分类号】R373.13          【文献标识码】A

前言

流感是一种急性呼吸系统疾病，全球每年约有5%～15%人感染该病毒，其中有25～50万人死亡[1]。流感一般由人－禽流感病毒重组引起，如A型H1N1、B型流感病毒等。流感具有季节性，患者伴有流鼻涕、高烧、咳嗽等症，目前多数流感病毒以突破屏障，具有可行的诊断及治疗方法。但流感病毒易发生抗原漂移、转变等现象，出现了病毒多亚型共存，而流感疫苗无法杀灭抗原变异流感病毒，故需研制可同时防御多种亚型流感疫苗病毒，根据生物机体常见纳米粒子铁蛋白纳米，综述了铁蛋白在疫苗开发中的应用。

1铁蛋白及流感综述

铁蛋白由1个蛋白外壳与1个矿物质内核组成，其中蛋白外壳由24个铁蛋白亚基组装而成，其中没3个亚基组成1个三聚体亚单位，8个三聚体亚单位组成空气U型纳米笼状结构，矿物质内核存在与该结构中，主要成分为水铁矿，为氧化结合位点。此外，矿物质内核中含有磷酸盐。铁蛋白具有稳定特征，在80℃的高温及变性剂影响下可保持结构稳定，但对pH较为敏感，在pH 2.0条件下蛋白壳会发生解体后蛋白亚基又可重新充足成完整铁蛋白，根据其耐高温特点进行分离纯化，同时可根据其对pH敏感特点可进行大批量生产重组铁蛋白，将药物或纳米颗粒装入铁蛋白中。此外，铁蛋白外壳除了化学方式进行修改，也可运用基因重组方式修改。1991年，英国学 Stephen Mann 实验室合成了磁性帖核，具有良好的相容性与分散性，易于靶向修饰，极大地推动了铁蛋白在生物医学中的领域[2]。

2流感疫苗现状

流感疫苗包括M2e纳米流感疫苗、HA2新型抗流感疫苗、亚单位疫苗、减毒活疫苗、DNA疫苗、通用型流感疫苗等[3]，其中减毒活疫苗较为常见，即利用基因重组技术达到与基因配种相似的减毒活疫苗毒株，该毒株具备流感部分活性，通过自然感染诱导黏膜免疫及全身免疫，临床试验中得到了良好效果，但在易感群体中有恢复毒力作用风险，出现肠套叠等副作用。

3自组装铁蛋白纳米抗原颗粒及流感疫苗制备方法

扩增铁蛋白及HA2．M2e．Ferritin进行基因引物，参照铁蛋白序列M12937.1加入HA2及M2e序列，形成HA2．M2e．Ferritin，设计出两种铁蛋白的引物，放置PCR管中依次加入PrimeSTAR Max Premix、模板、上下游引物、水扩增基因，取5μL行1%琼脂糖凝胶电泳，其余进行纯化，纯化步骤：加入5倍BB溶液混匀，放入10kg离心柱离心1min，分离出流出液，加入WB溶液离心1min分离出流出液，加入离子水离心1min，于－20℃保存。将纯化后铁蛋白进行双酶切，于装有混合物离心管37℃水浴锅中放置2h，将目的片段胶收回，收回步骤：将琼脂糖凝胶切下放入离心管中，加入traction Buffer放入50℃水中，凝胶融化后加入异丙醇转移到Spin column离心1min弃去液体，分别加入traction Buffer、Wash Buffer、Spin column、离子水离心并分别弃去液体。充足表达载体连接系后将两种产物进行连接转化，将混合物涂布培养基上，对质粒进行提取，将提取后的质粒放置于37℃水浴锅中2h进行重组酶切鉴定，将产物经琼脂糖凝胶检验。对重组质粒进行表达及纯化，对两种产物进行小量表达，各取1μL阳性质粒产物加入冰浴上30min，再放置42℃水浴中45s，快速置于冰上2min，加入LB(Luria-Bertani)细菌培养基培养基，放入培养箱1h，取出离心管离心3min，用200μL上清重悬细菌涂于LB平板；挑选单个菌落于6mL氨苄青霉素的LB液体培养基220 r/min过夜培养；培养后转入6mL 2YT培养基，220rpm/min 5h加入1mmol/L IPTG 24 μL，置于37℃培养8h；诱导的菌液置于4℃离心机并于冰上超声破碎[4]；对两种蛋白进行纯化。应用SDS-PAGE检测重组蛋白，配置蛋白胶，取2.7mL下层胶溶液及缓冲溶液混匀，加入改良保凝剂，加到制胶玻璃板中，加入适量去离水，检测重组蛋白免疫学活性，通过透射电镜进行观察，避免出现误差，再经过重组蛋白纳米粒度分析仪进行分析测试，对两种蛋白浓度进行测定，确保浓度正常。

4结果

理想的铁蛋白粒子为药物载体，可携带高质量治疗药物与特定靶细胞结合，同时具有一定的生物相容性与优越性。因铁蛋白相容性好、分散性高，是理想的药物纳米载体，与治疗疾病的抗体与毒素等活性蛋白小分子效果相同，实现对疾病的高效、低毒治疗[5]。

针对流感病毒最好的治疗方案莫过于防患于未然，而流感疫苗正是发挥预防作用的主要方式，传统流感疫苗多为减毒活疫苗，包括天然减毒株、基因重组弱等，此类疫苗虽具有一定作用，但在易感群体中有恢复毒力作用风险，出现肠套叠等副作用。而铁蛋白疫苗生产安全、高效、廉价，可避免传统疫苗在鸡胚、细胞中生产易于携带外源病毒风险，还可通过修饰提升免疫原性，具有重要意义。

铁蛋白广泛存在于各生物体内中，其相容性好、易修饰、承载量大等特点在医学领域受到极大应用，在生物医疗领域上，铁蛋白纳米粒子依旧存在较大潜力，需要我们进一步发现并开发。

参考文献

[1]郭玉堃,马英先,常雯茹,等. 水疱性口炎病毒核蛋白的纳米抗体和多聚抗核蛋白纳米抗体的原核表达及功能验证[J]. 中国兽医学报,2021,41(9):1762-1769.

[2] Ad A ,  Aoab C ,  Lsa B , et al. Effect of the 2020/21 season influenza vaccine on SARS-CoV-2 infection in a cohort of Italian healthcare workers[J]. Vaccine, 2022, 40(12):1755-1760.

[3]胡国梁,姚元波. 非小细胞肺癌患者外周血癌胚抗原、铁蛋白和神经元特异度烯醇化酶水平与肿瘤增殖、侵袭的关系[J]. 转化医学杂志,2022,11(2):88-91.

[4] Rastegar M ,  Tavana M ,  Meraj A , et al.An Inventory-Location Optimization Model for Equitable Influenza Vaccine Distribution in Developing Countries During the COVID-19 Pandemic[J]. Vaccine, 2021, 39(3):495-504.

[5]郭俊佳,王文玲,邓瑶,等. 甲型流感病毒核蛋白和基质蛋白2胞外域融合mRNA疫苗在小鼠体内的免疫应答研究[J]. 中华微生物学和免疫学杂志,2022,42(3):209-215.