试论HPLC校正因子法在药物分析中的应用

王珊

哈药集团技术中心

【摘 要】如今各国都开始重视对药物有关物质进行研究，同时我国展开对国内仿制药的评价，其中杂质对于主成分的校正因子测定开始逐渐的受到重视。文章首先对国内外在近些年中对校正因子的相关文献进行了详细的研究，接下来对校正因子的定义、测定方法和应用情况进行了详细的介绍，最后就当前杂质校正因子在测定和应用中存在的规律展开了阐述。希望文章所探讨的内容能够为今后校正因子测定的标准化和规范化提供相关参考。

【关键词】HPLC；校正因子；响应因子；主成分自身对照法；对照品替代法

在对药品质量进行控制和对纯度和含量进行分析时首先选择的就是标准物质，不过标准物质在供需上存在一定的矛盾，例如有些物质在获取上是具有一定难度的以及如果对多种标准物质进行同时使用将会造成高昂的检测成本，这些因素都会对标准物质的使用造成限制。为了对这一问题进行有效的解决，找出了该可以代替该检测方法的方法即高效液相色谱校正因子法。该检测方法的主要作用是检测HPLC有关物质，中的特定杂质，然后有逐渐应用在对中药多指标含量的测定，在对该检测方法进行长时间的使用下如今该方法已经发展成了相对成熟的分析方法，近年来我国仿制药的一致性评价已经得到了深入的研究，在药品中的有关物质是关键质量属性，该物质被视为是重点评价对象之一，不过在有关物质的申报资料当中关于校正因子研究的相关内容是缺少的，因此药品审评中心向企业发出通知要求企业补充校正因子的相关材料。如今校正因子的研究已经重新被相关企业和科研单位所重视，现阶段，国内外针对校正因子测定和应用的相关指导非常少，因此本文对近些年国内外相关领域进行了研究，希望能够对校正因子测定和应用中存在的问题和规律进行做出了相应的总结。

1定义

在HPLC法定量测定中通常所讲的校正因子是某物质i与所选定的参照物质的绝对校正因子之比，即相对校正因子，校正因子在各国药典中均有应用，只是表述方式不尽相同。《中国药典》与《欧洲药典》（EP10.0）基本一致，使用校正因子（correction factor）的概念，差别在于国内要求当已知杂质对主成分的相对校正因子在0.9~1.1内时，可以用主成分自身对照法计算杂质的含量，超出这个范围时宜用杂质对照品或者加校正因子的主成分自身对照法计算杂质的含量；而EP10.0中则规定校正因子在0.8~1.2时仍可使用主成分对照法计算杂质含量。《美国药典》（USP）中给出了相对响应因子（relative response factor）的概念，从其各论中具体计算方法可以推导出相对响应因子与相对校正因子是互为倒数的关系，在使用时需要注意将待测峰面积（A）与校正因子相乘或与相对响应因子（f）相除以校正峰面积。其中c为待测物和参比物溶液浓度。另外校正因子的使用也有一定的范围，如校正因子在0.2~5.0的范围以外时，表明杂质与主成分的UV吸收相差过大，校正因子的作用会受到显著影响，此时应改变检测波长等检测条件，使校正因子位于上述范围内。

2测定方法

2.1 HPLC-UV/PDA方法

2.1.1单点法制备

准备好适当浓度的待测物对照溶液和参比物对照品溶液，在两个对照品溶液中均加入了液相色像谱仪，按照相应的计算公式得出校正因子。该实验方法的优点在于操作起来相对简单，缺点在于对样品进行处理或者是检测过程中无法对其过程中的偶然误差进行准确的排除，同时，在对众多的文献进行检索后发现YUAN等应用一个浓度点的平行测定两组结果的校正因子是测定两组结果的平均值，该校正因子主要用途为对羟苯乙酯替代大蒜辣素标准物质对样品中大蒜辣素的含量进行测定。

2.1.2多点法制备

多点法制备方法分别对浓度不同的待测物对照品溶液以及参比物对照溶液进行量取，如果是利用加校正因子主成分自身对照法来对杂质的含量进行计算，对该方法提出了相应的建议即为加工待测物和参比物浓度包括了两种限度分别是定量限度和标准限度，将这两种物分别向液相色谱一进行注入并对二者进行测定，使用公式对多个校正因子值进行计算，其校正因子就是其计算后所取的平均值，当前对该测定方法的应用范围是非常广泛的，但是很少将其应用在杂质含量的确定中。

2.1.3标准曲线法

目前，校正因子的测定最常用的方法还是标准曲线测定法。具体操作如下：精密称取待测物对照品和参比物对照品各适量，分别配制成不同浓度的系列溶液，如果是加校正因子的主成分自身对照法计算杂质含量用，则建议待测物和参比物浓度涵盖定量限和标准限度[5]，分别注入液相色谱仪进样测定，以浓度c为横坐标，峰面积A为纵坐标，分别绘制参比物和待测物标准曲线A=kc+b，当b=0时，可以推导出两者的相对校正因子为二者斜率k之比[11]，2.1.4联立方程法

前述3种HPLC方法使用的前提就是待测物和参比物最好备有色谱纯的化学试剂或标准物质，即使没有色谱纯，也要确知物质的百分含量。但在药物研发的早期，很难得到已知杂质的纯品，因此，Yu提出了一种无纯样色谱校正因子的测定方法。根据校正因子与峰面积成正比（校正因子是常数的条件）的前提，设一“标”样仅含A、B二组分且都出峰，各组分的量之和为一定值（如A、B两组分含量之和为100%），因而可建立各组分的量之和与校正因子、峰面积三者之关联式，另一“标”样亦仅含A、B二组分，但峰面积有差异（即二组分含量有异），同样可建立三者关联式，解两个关联式即可得各组分校正因子。

2.2紫外吸光系数比值法

结合文献，证明了两物质的相对校正因子是两者的百分吸光系数（E）之比。因此可按吸光系数测定的相关技术要求，如对照品级别的标准物质、高中低三水平浓度测定、吸光度介于0.3～0.8之间、至少5台不同型号的UV分光光度计、2份供试液同时平行制备测定、同台仪器2份供试液的平行测定结果不超过±0.5%等，以流动相为溶剂，测定待测物和参比物在检测波长处的紫外吸收系数E1%1 cm，计算比值，求得校正因子。

2.3 HPLC联用其他方法

利用其它检测器来对HPLC-UV/PDA进行检测却很难对其中的待测物和参比物中的标准物质进行准确的测定，曾有研究者经过对其研究提出了将通用型质量检测器技术和PDA或UV检测器进行串联并将该方法确定为校正因子的方法。最终确定这种通用型质量检测器检测后所形成的峰面积和对应的进入检测器的分析物之间形成了正比，但是峰面积和分析物结构特性之间是没有关系的。由此可以得出的结果为检测器中待测物和参比物之间的所存在的数量关系，将所得到的的关系和UV/PDA检测器相结合最终得出峰面积，最后通过公式来推导出待测物对于参比物的校正因子。

3展望

综上所述，随着人们的生活水平的不断提高，大众对身体健康提出了新的认知，开始越来越重视药品所具有的安全性，对药品中有关物质中的特定杂质进行检查控制是对药品质量继续拧控制的常态，当标准物质无法正常供应时，会普遍使用校正因子计算特质杂质法，而在药品HPLC方法中用于杂质含量测定和限度检查时其中最为关键的参数之一就是相对校正因子，国内外如今已经开始广泛的对校正因子方法用在药品中的杂质控制，同时有很多的方法已经开始被各过收到药典当中，由此可见该方法在未来会有一个好的发展前景，各国应当对校正因子方法研究中所存在的问题进行更加深入的研究。

参考文献

[1] 肖亭, 王晨, 姚尚辰,等. HPLC校正因子法在药物分析中的应用[J]. 药学学报, 2020, 55(12):8.

[2] 董南. HPLC法在某些药物分析中的应用研究[D]. 云南大学.

[3] 李木子, 王京辉, 郭洪祝,等. HPLC法测定白术饮片中多种化学成分的含量[J]. 药物分析杂志, 2017, 37(9):8.