黄芍颗粒治疗糖尿病周围神经病变的网络药理学研究

范蕴隆，唐英，张艳红

上海中药制药技术有限公司 上海市 201318

摘要： 目的 探索黄芍颗粒治疗糖尿病周围神经病变（Diabetic peripheral neuropathy, DPN）的作用机制 方法 运用TCMSP、Genecards和OMIM数据库收集活性成分及靶点。通过String数据平台构建PPI网络，再利用Metascape数据库进行GO与KEGG富集分析，来获得核心靶点与通路。结果 筛选得到黄芍颗粒的90个活性成分与294个靶点，DPN相关靶点1404个，取交集后得到靶点128个。构建PPI网络后利用Cytoscape分析，得到PPI核心靶点17个。富集结果发现，这些靶点涉及多个生物过程以及160条通路。经过Cytoscape分析得到MAPK1、AKT1、RELA、MAPK8、TNF共5个核心靶点，和以AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications为首的17条核心通路，它们在黄芍颗粒治疗DPN的过程中可能发挥重要作用。结论 黄芍颗粒可通过MAPK1、AKT1 等靶点，调控AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications等信号通路来治疗DPN。

关键词：黄芍颗粒； 糖尿病周围神经病变； 网络药理学；作用机制

糖尿病周围神经病变（Diabetic peripheral neuropathy, DPN）是糖尿病（Diabetes Mellitus, DM）病人的常见并发症，也是神经病变的常见原因之一，，对于患者的身心健康与生活质量造成巨大影响^[1-3]。

复方黄芍颗粒由知名糖尿病专家朱禧星教授总结中医传统理论，结合临床治疗经验而得的临床验方。该方以养阴降糖，活血化瘀为主，兼具化痰驱邪，通络开痹的功效。针对中药组方多组分、多靶点、多通路的治疗特征，可以采用基因组学、系统生物学、计算机科学等多学科共同分析，全面系统地反应药物与疾病的相互关系。本研究利用网络药理学对黄芍颗粒治疗糖尿病周围神经病变过程中，涉及的有效成分、相关靶点与信号通路之间的机制联系进行探讨，阐明其药理机制，为治疗这一疾病提供理论依据。

1 实验方法

1.1 有效活性成分的收集筛选

利用TCMSP数据库（https://tcmsp-e.com/）收集黄芍颗粒中十二味中药的主要化学成分，以口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%、类药性（Drug-likeness,DL）≥0.18^[17]为标准，结合文献报道，筛选出有效活性成分。

1.2药物靶点收集与“成分—靶点”网络构建

利用TCMSP数据库对筛选得到的黄芍颗粒有效活性成分进行靶点预测，在UniProt(http://www. uniprot.org/)蛋白数据库中获得靶点规范名称；将有效活性成分与作用靶点信息整合后，导入Cytoscape 3.8.1软件（www.cytescape.org）进行可视化分析，构建“成分—靶点”网络图。

1.3疾病靶点收集、潜在作用靶点筛选与PPI网络构建

以“Diabetic Peripheral Neuropathy”为关键词，利用GeneCards（https://www.genecards.org/）数据库和OMIM数据库（http:www.omim.org）组合检索，分析获取黄芍颗粒治疗糖尿病周围神经病变的潜在作用靶点。将靶点导入String平台（https://string-db.org/），进行蛋白-蛋白相互作用（PPI）在线分析，以Cytoscape对结果作出进一步可视化处理筛选。

1.4 GO生物过程与KEGG通路富集分析

用Metascape数据库(https://metascape.org)对黄芍颗粒治疗DN的潜在靶点进行GO生物进程（Biological Processes）与KEGG通路的富集分析，设置P值小于0.01，并以P值筛选排名靠前的内容进行可视化处理并分析阐明。

1.5 核心靶点与通路筛选

将黄芍颗粒的作用靶点及其富集通路信息导入 Cytoscape 3.6.1 软件中，绘制黄芍颗粒“靶点—通路”相互作用网络图，并借助该软件的进行拓扑学参数分析，筛选出治疗过程中的核心通路及靶点。

2 结果

2.1成分筛选情况

通过TCMSP数据库检索，以OB≥30%、DL≥0.18为标准，结合文献报道筛选去重后，共得到有效活性成分90个。其中由于几味药在TCMSP数据库中搜索到的化学成分较少，因此采用TCMSP数据库与化学专业数据库结合的方式（http://www.organchem.csdb.cn/scdb/default.htm）收集成分，与相同方法进行处理后而得到有效活性成分。

2.2 “成分—靶点”网络图构建

借助TCMSP数据库进行靶点预测，得到黄芍颗粒有效活性成分的作用靶点共294个，所构建的黄芍颗粒“成分—靶点”网络图如下所示。图中包含384个节点和1216条边，外围六角形图案表示黄芍颗粒的活性成分，中央矩阵排列的菱形图案表示作用靶点，边（Edge）表示靶点与成分之间的相互作用，度值（Degree）代表节点之间的连接程度，其值越大，越有可能成为核心成分或靶点。

经过拓扑学分析可知，槲皮素（quercetin，MOL000098，A1）、山奈酚（kaepferol，MOL000422，A5）、汉黄芩素（wogonin，MOL000173，FF2）是对应靶点最多的活性成分；而PTGS2、PTGS1、HSP90AB1是活性成分作用程度最高的靶点，它们可能会在糖尿病周围神经病变的治疗中起到关键作用。此外，本网络平均节点度值为6.33，且有144个靶点节度值大于2，即48.9%的靶点与至少两种有效活性成分相连，表明黄芍颗粒具备多组分多靶点的作用特点。

图1黄芍颗粒成分-靶点网络

2.3 药物与疾病靶点的关联及PPI网络构建

借助GeneCards数据库和OMIM数据库组合检索，共得到与糖尿病周围神经病变相关靶点1404个。药物与疾病的靶点重合情况如下图2所示，得到128个潜在作用靶点。导入String作图，以最低相互作用阈值为0.900去除相互作用较低的蛋白，得到PPI网络，进行可视化分析。图3中包含121个节点与545条边，平均度值为9.01，说明这些靶点的相互作用密切，具备良好的生物学意义。图形大小和颜色深浅（由深红到浅蓝）反映在网络中的重要性；连线粗细反映两两靶点之间的关联程度。以度值排序，通过其平均值筛选两次，得到连接度大于16的靶点共17个，作为核心靶点作为核心PPI网络，具体信息见表1。重新作图如图4所示，它们可能是黄芍颗粒治疗糖尿病周围神经病变的关键靶点。

图2黄芍颗粒与糖尿病周围神经病变重合的靶点韦恩图

图3黄芍颗粒潜在靶点的PPI网络

表1潜在靶点PPI网络中度值、介值中心度、接近中心度靠近中心的靶点

靶点	度值	介值中心度	接近中心度
AKT1	35	0.130176	0.495868
TNF	32	0.098062	0.515021
JUN	31	0.055656	0.510638
RELA	30	0.05106	0.497925
TP53	30	0.085836	0.493827
MAPK1	27	0.068465	0.497925
IL6	25	0.049323	0.465116
MAPK14	24	0.058758	0.491803
EGFR	23	0.04838	0.474308
MAPK8	23	0.029899	0.45977
VEGFA	22	0.058022	0.478088
FOS	19	0.012715	0.458015
ESR1	19	0.06077	0.472441
MYC	18	0.024518	0.46332
EGF	18	0.03047	0.447761
CXCL8	18	0.044255	0.434783
IL4	17	0.018578	0.433213

图4 黄芍颗粒潜在核心靶点的PPI网络

2.4 基因富集分析

分析结果表明，黄芍颗粒治疗糖尿病周围神经病变的过程中，参与多个生物过程，涉及多条信号通路（共318条）。各自选择排名靠前的20个富集生物进程与通路进行可视化分析，颜色由淡蓝转深红，代表p值逐渐减小，显著性升高；点面积越大，代表富集的靶点越多。图5A的GO分析结果中，排名靠前的生物过程包括对无机物、脂多糖机体及营养水平的响应，对炎症、细菌、外周刺激及伤口的反应，对氧化应激、活性氧的响应与代谢过程等，提示黄芍颗粒对糖尿病周围神经病变复杂的症候与病程形成较为庞大而复杂的生物调控作用，符合中医理论中的整体观念。图5B与表2的KEGG基因富集通路结果显示，AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、Fluid shear stress and atherosclerosis、PI3K-Akt为基因富集量最多的三条通路，分别为33，32和30个；各通路中富集程度最高是Pancreatic cancer，其次是AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications和PI3K-Akt；此外MAPK signaling pathway、IL-17 signaling pathway与TNF signaling pathway通路的靶点富集程度较高，基因富集量也较大这些通路在黄芍颗粒的治疗过程中也可能起到较为关键的作用。

图5 黄芍颗粒潜在靶点的GO与KEGG富集分析结果（P<0.01，按P值取前20条）

表2 黄芍颗粒潜在靶点KEGG富集分析中P值靠前的20条靶点信息

编号	名称	富集程度	P	靶点命中数
ko04933	AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications	69.5358	6.46301E-53	33
ko05418	Fluid shear stress and atherosclerosis	47.01012	4.91814E-45	32
ko04668	TNF signaling pathway	46.3572	1.16507E-33	24
ko04657	IL-17 signaling pathway	49.34799	1.43317E-31	22
ko05142	Chagas disease (American trypanosomiasis)	44.99375	1.36722E-30	22
ko05164	Influenza A	30.14558	5.2295E-30	25
ko05205	Proteoglycans in cancer	26.71819	9.09727E-30	26
ko05145	Toxoplasmosis	40.61383	1.60981E-29	22
ko04151	PI3K-Akt signaling pathway	58.67083	2.80618E-29	30
ko05212	Pancreatic cancer	76.31978	1.64852E-27	18
ko05144	Malaria	25.6389	9.08844E-26	16
ko05219	Bladder cancer	39.11389	4.15126E-25	15
ko05152	Tuberculosis	40.76237	7.1938E-25	22
ko01522	Endocrine resistance	16.74441	5.51681E-24	18
ko01521	EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance	39.73474	8.18002E-24	17
ko05215	Prostate cancer	17.11233	4.90484E-23	17
ko04010	MAPK signaling pathway	46.75683	8.00775E-23	23
ko05140	Leishmaniasis	42.37338	1.30032E-22	16
ko05206	MicroRNAs in cancer	23.1786	1.42105E-22	24
ko04210	Apoptosis	38.51214	1.45838E-22	19

2.5 “靶点—通路”网络图构建

网络图绘制结果如图6所示，该网络由288个节点及1603条边组成，平均节点度值为11.13。中央矩阵排列的菱形紫色图案代表潜在靶点，外圈砖红色三角形代表靶点富集通路，形状越大代表重要性越大。结合图1和表1，黄芍颗粒治疗DPN的过程即为90个有效成分包括槲皮素、山奈酚、汉黄芩素等通过作用于MAPK1、AKT1 等128个潜在靶点，再富集到160条信号通路上。

图6 “靶点-通路”网络图

通过拓扑学参数分析，以Degree值、BC值和CC值分别筛选得到的核心靶点与核心通路，详见表3和4。

表3 核心靶点及其网络拓扑学参数

靶点	节度值	中介中心值	接近中心值
MAPK1	77	0.121193	0.44704
AKT1	63	0.093109	0.430931
RELA	49	0.039069	0.399721
MAPK8	48	0.039338	0.401961
TNF	48	0.058352	0.401961

表4 核心通路及其网络拓扑学参数

编号	名称	节度值	中介中心值	接近中心值
ko04933	AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications	33	0.049342	0.413545
ko05418	Fluid shear stress and atherosclerosis	32	0.059893	0.396409
ko04151	PI3K-Akt signaling pathway	30	0.032452	0.40767
ko05205	Proteoglycans in cancer	26	0.028344	0.394231
ko05164	Influenza A	25	0.027113	0.400838
ko04668	TNF signaling pathway	24	0.018847	0.385753
ko05206	MicroRNAs in cancer	24	0.061767	0.394231
ko04657	IL-17 signaling pathway	22	0.015561	0.381649
ko05142	Chagas disease (American trypanosomiasis)	22	0.013387	0.387838
ko05145	Toxoplasmosis	22	0.017999	0.391008
ko05152	Tuberculosis	22	0.013329	0.388889
ko05140	Leishmaniasis	21	0.012791	0.385753
ko05166	HTLV-I infection	21	0.009825	0.374674
ko04060	Cytokine-cytokine receptor interaction	21	0.01036	0.349148
ko04510	Focal adhesion	20	0.014239	0.377632
ko04210	Apoptosis	19	0.010468	0.374674
ko04932	Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD)	19	0.009492	0.375654

由表3 可见，MAPK1、AKT1、RELA、MAPK8、TNF基因是黄芍颗粒有效成分治疗糖尿病周围神经病变的核心作用靶点。由表4 可见，AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、Fluid shear stress and atherosclerosis、PI3K-Akt signaling pathway等17条通路是黄芍颗粒有效成分治疗糖尿病周围神经病变的核心作用通路。分析过程中发现，“靶点-信号通路”网络涉及多条与甲型流感、肺结核、癌症等疾病直接相关的通路，这符合糖尿病发展加重过程中常伴随其他多项严重并发症的特征。

3 讨论

对于糖尿病周围神经病变，目前临床多以控制血糖、营养神经、抗氧化损伤的药物为主，但往往由于无法有效应对进行性血管损害，且发病机制不明；而与之相对，中医在治疗DPN方面已有多个行之有效的辩证治疗理论与长足的临床经验支持。一般认为，DPN有“痛症”、“血痹”、“厥症”、“汗症”等症候，属于中医中“消渴脉痹”、“痹症”的范畴。DPN病情初期大多不甚明显，且病机复杂，尚未有统一说法，但基于《黄帝内经》关于糖尿病“五脏皆柔弱，善病消痹”的理论可以看出，其病程的发展与糖尿病的本虚标实相吻合，患者多由于阴虚燥热煎灼日久，从而导致瘀阻脉络^[20]。鉴于中药多成分多靶点的特征，本研究旨在通过网络药理学的手法，对黄芍颗粒治疗DPN的作用机制进行探索与阐述。

本研究中得到的关键有效成分主要有槲皮素、山柰酚、汉黄芩素等。槲皮素具有扩血管、抗炎、抗氧化、降血糖的药理功能。有研究表明槲皮素可显著降低脑梗死体积与MDA含量，缓解神经功能缺损，增强存活神经元密度与SOD活性，对神经起到保护作用^[21]。通过对VEGF、eNOS等通路的调控，槲皮素还能够延缓血管内膜增生，减轻血管病变发展^[22]。山柰酚同样具有降血糖、抗氧化的活性作用，能够通过降低晚期糖基化终末产物（AGEs）的生成，改善代谢紊乱。减少由氧化应激介导的促炎因子的释放等方式，降低神经的炎症反应与损伤^[23-24]。汉黄芩素是黄芩中的一类黄酮类成分，能够抑制高糖环境所诱导的炎症反应、脏器损伤以及自噬障碍，提高免疫功能，这些作用通常与PI3K/Akt/NF-κB、TGFβ1/Smad3等通路有关^[25-26]。

黄芍颗粒治疗DPN的潜在核心通路包括AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、Fluid shear stress and atherosclerosis、PI3K-Akt signaling pathway等。AGEs是长期高糖状态下，葡萄糖与蛋白质、脂类、核酸等物质共同发生一系列非酶性生化反应后得到的产物，与其受体RAGEs构成的系统在DPN发生发展过程中起到关键作用，包括神经髓鞘的脱落，以及轴突的功能受损、结构变性和萎缩^[28]。此外，AGEs-RAGE通路的激活会造成内皮细胞稳态的紊乱，导致脏器纤维化以及血管增生，并通过NADPH氧化辅酶系统的相互作用等方式造成ROS的大量累积^[29-30]。伴随着氧化应激状态的加剧，AGEs-RAGES还将造成IL-6、TNF-α等炎症因子表达的显著提高，激活包括MAPK、TGF-β，NF-κB、PI3K/Akt在内的通路，造成血管与神经严重的损伤与凋亡^[31]。流体剪切应力与动脉粥样硬化（Fluid shear stress and atherosclerosis）通路与MAPK、NF-κB、PI3K/Akt、JAK/STAT等多条信号通路密切相关，在糖尿病患者中出现动脉粥样硬化的比例远高于血糖正常人群，因此该通路在DPN患者中可能呈现高表达^[32]。PI3K/Akt通路是一种重要的信息传导应答通路，在糖尿病病人中通常呈现高度抑制的状态^[33]。该通路的激活能够显著减轻机体炎症反应（NF-κB等）、改善糖脂代谢（胰岛素重要的信号传导途径）、对抗氧化应激（Nrf2等）^[34-36]。与此同时，由于其在细胞增殖分化、黏附、运动等多类功能中发挥重要作用，因此被认为是DPN神经疼痛诱发和维持的关键所在^[37]。

综上，本研究借助网络药理学，为黄芍颗粒治疗DPN提供了一定的理论依据，为后续研究内容做出参考。针对多成分、多靶点的中药方剂，合理应用这一技术将有助于提高研究效率，优化技术资源。本研究主要涉及理论分析，存在一定局限性，后续还需要进行分子对接、动物或临床药效实验进行论证方可作为可靠依据。

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基金项目：上海市2017年度“科技创新行动计划”生物医药领域科技支撑项目（17401902500）