扩环酶的固定化研究

孙晴 1 2 ,祁浩杰 1 2 ,闫志斌 1 2 ,侯鹏飞 1 2 ,刘兴 1 2

天俱时工程科技集团有限公司，河北省 石家庄市 050000

河北制药用酶集成应用技术创新中心，河北省石家庄市050000

摘要：半合成青霉素类和头孢菌素类抗生素市场需求巨大，化学合成法生产费用高且污染环境严重，生物法中的扩环酶是合成头孢菌素的关键酶，它决定着头孢菌素的产量。通过共价结合的方式将扩环酶固定在载体的表面，考察在固定化时各个反应条件对酶活的影响规律，确定酶固定化温度为25℃，K₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲溶液浓度为1.5mol/L，反应时间为4h，每克树脂的酶液加入量为12mL时，固定在树脂上的扩环酶具有最佳催化活性。本研究为固定化酶反应的工业化生产提供了实验依据，为企业进一步降低成本、提高效益提供了参考与借鉴，具有实际应用价值。

关键词：扩环酶；树脂；固定化；酶活

β-内酰胺类抗生素指化学结构中具有β-内酰胺环的一大类抗生素，其中青霉素类和头孢菌素类应用最为广泛^[1]。青霉素抗菌谱窄，且易引起过敏反应，目前已经不直接使用，多用于合成头孢菌素类抗生素^[2]。头孢菌素具有高抗菌强度和稳定性的优点，广泛应用于临床上^[3]。化学法合成头孢菌素类步骤繁琐，反应条件苛刻，生产过程中使用了大量有机溶剂^[4]。由于化学法生产费用高而且污染环境严重，现在多采用生物催化合成法^[5]。生物催化合成法是利用扩环酶催化青霉素底物扩环生成7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸(简称7-ADCA)，然后在7-ADCA上添加相应侧链，生产具有不同抑菌活性的头孢菌素类抗生素^[6]。7-ADCA是合成头孢菌素的重要中间体，而扩环酶是生成7-ADCA的关键酶。固定化酶比游离酶性能稳定，催化性能更高^[7-8]。所以，探索高效的酶固定化方法，可以提高头孢菌素的合成技术和产量，以满足国内外市场对半合成青霉素类和头孢菌素类抗生素的需求。

根据酶和载体之间的相互不用，酶固定化有包埋法、吸附法、交联法、共价结合法、氨基酸置换法和生物素-亲和素亲和法等多种方法。其中的共价结合法使酶和载体之间的结合性更强，酶与载体间产生的强化学键可显著减少酶的散失,提高酶的重复利用率^[9]。酶固定化后生成新的酶系统,使酶可以在催化反应中重复使用,降低了生产成本^[10-11]。现在酶已经广泛应用于医药、食品、能源、水处理、纺织等许多产业领域。李源勋等以丙烯酸(AA)为单体,二乙烯基苯(DVB)为交联剂在致孔剂石油醚存在下,利用悬浮聚合法制备一系列不同物质的量比的AADVB二元聚合物,用其作为载体对青霉素酰化酶进行固定^[12]。鲜海军等以酸部分水解聚丙烯腈纤维为载体,以戊二醛为交联剂,共价键结合制备了固定化胞外青霉素G酰化酶,所得的固定化酶具有活力高、稳定性好和能水解高浓度青霉素钾盐的特点^[13]。

本研究采用聚甲基丙烯酰胺合成的表面带有环氧基团的大孔树脂作为载体，将酶分子与载体的活性基团通过共价键连接，使扩环酶固定化。此方法制得的固定化酶具有良好的机械强度和稳定性，是目前工业化应用和实验研究中最常用的固定化方法。

1材料与方法

1.1仪器与试剂

仪器：酸碱自动滴定仪，上海仪电科学仪器股份有限公司；低温恒温反应浴，巩义市英峪高科仪器厂；电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；酸度计，梅特勒-托利多仪器有限公司等。

试剂：ES-103B环氧树脂，天津南开和成公司；扩环酶溶液，华北制药股份有限公司；磷酸二氢钾，天茂化工有限公司；磷酸二氢钾，天茂化工有限公司；氢氧化钠，天茂化工有限公司；青霉素G，河南华星药厂。

1.2方法

1.2.1酶固定化

1）固定化实验

称取ES-103B树脂1g，用0.5mol/L的K₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲溶液（pH7.0）洗涤至电导率为500μS/cm以下，去除溶液后树脂待用。取10mL扩环酶溶液到50mL反应瓶中，加K₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲溶液到20ml刻度处，混合均匀后加入洗涤后的树脂，置于25℃的恒温反应浴中进行固定化，6h后取出固定化酶检测酶活。

2）反应条件对固定化的影响

在扩环酶进行固定化时，反应条件对固定化酶的酶活至关重要。分别设置水浴温度为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃进行温度对固定化的影响实验；分别设置K₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液浓度为0.05mol/L、0.1mol/L、0.5mol/L、1 mol/L、2 mol/L进行缓冲液对固定化的影响实验；分别设置固定化时间为1h、2 h、4 h、6 h、8 h进行反应时间对固定化的影响实验；分别设置酶液加入量为5ml、8ml、10 ml、12 ml、15 ml进行反应酶液和树脂添加比例对固定化的影响实验。

1.2.2酶活测定方法

称取青霉素G钾盐1.00 g至四口烧瓶中，加入50ml K₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲溶液，调节水浴温度为32℃，设置自动滴定仪pH值为7.5，加入固定化酶1.00g后开启自动滴定。反应时间6分钟，记录消耗的NaOH溶液的体积。

根据下列公式计算固定化酶的酶活。

在上述公式中，C_NaOH表示NaOH溶液的浓度，mol/L；V_NaOH表示消耗的NaOH溶液体积，L；W_固酶表示固定化酶的重量，g。

2结果与分析

2.1温度对酶固定化的影响

图1是固定化时温度对酶活的影响情况。可以看出，在不同的温度下进行的固定化实验，25℃时酶活最高，随着温度继续升高，酶活开始下降。究其原因，温度升高有利于酶的扩散和键合反应，但是温度过高，致使酶蛋白失活变性。因此，确定酶固定化时温度为25℃。

图1温度对酶活影响

2.2缓冲液浓度对酶固定化的影响

图2是固定化时，缓冲液浓度对酶活的影响情况。如图所示，随着缓冲溶液浓度的升高，酶活也随之增大，当K₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲溶液的浓度为1.5mol/L时，酶活达到最高。K₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲溶液的盐析作用可以使酶蛋白溶解度降低，促使酶在树脂载体上聚集，提高固定化的效率。因此，确定酶固定化缓冲液浓度为1.5mol/L。

图2缓冲液浓度对酶活影响

2.3反应时间对酶固定化的影响

图3是固定化时间对酶活的影响情况，如图所示，随着反应的进行，酶被吸附在载体表面，酶活开始上升，在4h时酶活达到最大值，时间加长后，酶活呈现出下降趋势。这可能是由于载体上所固定的酶达到饱和，过剩的载体活性集团会和酶形成多点固定，从而降低了酶的活性。因此，确定酶固定化反应时间为4h。

图3固定化时间对酶活影响

2.4酶液加入量对酶固定化的影响

图4是酶液加入量对酶活的影响情况，如图所示，随着酶液加入量的增加，固定化酶的酶活也随之增大。当加入量为12mL时，酶活达到最大值。继续增加酶液量，酶活基本不变，酶在树脂表面达到吸附平衡。因此，确定酶液加入量为12mL。

图4酶液加入量对酶活影响

3结论

近年来,头孢菌素类抗生素的生物合成受到越来越多的关注,而扩环酶是合成过程途中最重要的限速酶。

本研究选择ES-103B环氧树脂作为实验载体，通过共价结合的方式将酶固定在载体的表面。在固定化时，考察各个反应条件对固定化酶的酶活影响。确定酶固定化温度为25℃，K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液浓度为1.5mol/L，反应时间为4h，每克树脂的酶液加入量为12mL时，固定在树脂上的扩环酶具有最佳催化活性。本研究为固定化酶反应的工业化生产提供了实验依据，为企业进一步降低成本、提高效益提供了参考与借鉴，具有实际应用价值。

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第一作者：孙晴(1983年—)，女，本科，工程师。研究方向：工业废水处理技术、制药用酶固定化技术。[e-mail]。

中图分类号Q814 文献标识码A