小白鼠组织石蜡切片制备法的探讨

周剑莉

井冈山大学医学 部 ，江西 吉安 343000

［摘要］ 目的 探讨小白鼠全身主要组织器官石蜡切片制备。方法 将固定好的各类组织按脱水透明的时间分为五个实验组分别进行脱水透明实验，得到最适合每种每种组织器官最脱水透明时间与方法。 结果：小白鼠组织块的最佳脱水时间是在浓度梯度分别 60 %、75 %、80%、95 %Ⅰ、95 %Ⅱ的 各级乙醇中脑、肺为30min，肝、脾为 40min，心、肾 60 min，皮肤为75min，在浓度 100 %Ⅰ、100 %Ⅱ乙醇中各 30 min。透明时间脑、肺在二甲苯Ⅰ和Ⅱ中各20min,肝、脾在二甲苯Ⅰ和Ⅱ中各30min，心、肾在二甲苯Ⅰ和Ⅱ中各40min，皮肤在二甲苯Ⅰ和Ⅱ中50min。 结论：按本实验得出的各组织器官最佳脱水透明时间所制备的小白鼠组织切片蜡带连续，切片平整均匀，经HE染色后观察组织形态完整，染色对比鲜明，很好的满足科研工作的需要。

［关键词］ 石蜡切片 脱水 透明 浸蜡

［中图分类号］ R 331 ［文献标识码］A ［文章编号］

小白鼠是最常使用的实验动物之一，其作为实验载体广泛应用于医药和生命科学领域，但因为其组织结构柔软小，纤维组织又较少，所以使用常规方法制作的切片往往达不到很好的效果，本课题组通过对制片过程中的关键步骤--脱水透明处理时间上的反复实践与摸索，得到适合小白鼠全身主要组织器官切片的制备方法。^[1]

1材料与方法：

1.1材料与仪器：（1)实验动物：清洁级健康雄鼠40只，鼠龄在4-6个月，体重290-350克，由井冈山大学动物实验室提供。（2）试剂：10%福尔马林液(北京雷根生物有限公司），无水乙醇（无锡佳妮化工有限公司）、二甲苯（天津致远化学试剂有限公司），切片石蜡，旋转式切片机（德国莱卡），苏木素-伊红（HE）染色液(北京雷根生物有限公司）。

1.2方法; 小白鼠用颈椎脱臼法处死，取其大脑，肝脏，脾脏，心脏，肺脏，肾脏，皮肤等七种组织，切取的组织块厚度一般为 0.4 cm -0.8 cm，大小 1.0 cm-1.5 cm。将其放入10%的中性甲醛中各固定24小时。

1.2.1 分组 将固定好的组织按脱水透明的时间分为五个实验组，每组包含脑，肝，脾，心，肺，肾，皮肤各2块组织。

1.2.2脱水 将固定后的组织切面朝下置于一次性塑料脱水包埋盒中，于室温下开始阶梯脱水。最常用的脱水剂是乙醇,高浓度脱水剂穿透组织的速度很快，容易导致组织过度收缩和变脆，因此先从低浓度乙醇开始，逐渐递增浓度至无水乙醇: 60% 乙醇→ 75%乙醇→80% 乙醇→ 95%乙醇Ⅰ→95%乙醇Ⅱ。^[2]

实验一组 脱水时间: 60% 乙醇→ 75%乙醇→80% 乙醇→ 95%乙醇Ⅰ→95%乙醇Ⅱ各30min.

实验二组 脱水时间: 60% 乙醇→ 75%乙醇→80% 乙醇→ 95%乙醇Ⅰ→95%乙醇Ⅱ各40min.

实验三组 脱水时间: 60% 乙醇→ 75%乙醇→80% 乙醇→ 95%乙醇Ⅰ→95%乙醇Ⅱ各50min.

实验四组 脱水时间: 60% 乙醇→ 75%乙醇→80% 乙醇→ 95%乙醇Ⅰ→95%乙醇Ⅱ各60min.

实验五组 脱水时间:60% 乙醇→ 75%乙醇→80% 乙醇→ 95%乙醇Ⅰ→95%乙醇Ⅱ各75min.

另每组在无水乙醇Ⅰ无水乙醇Ⅱ中的时间均为30min.

1.2.3 透明 脑、肺在二甲苯Ⅰ和Ⅱ中各20min,肝、脾在二甲苯Ⅰ和Ⅱ中各30min，心、肾在二甲苯Ⅰ和Ⅱ中各40min，皮肤在二甲苯Ⅰ和Ⅱ中50min。

1.2.4 浸蜡与包埋 浸蜡在温度在60℃的石蜡Ⅰ和石蜡Ⅱ中各1h，浸蜡结束后立刻进行包埋，包埋时石蜡温度要与组织温度相近，先向金属包埋模具内注入一定量蜡液，再将组织切面向下放入。

1.2.5切 片 使用德国徕卡ＲM2235 型轮转切片机在室 温 进行 切 片，先 修 片，修 出较完整组织面后改用４μｍ切片，摊片水温４2℃，贴片时载玻片倾斜 45度入水，垂直捞起，切片时注意观察能否连续高质量切片，蜡片是否厚薄均匀，平展无裂痕；是否出现破碎、散片，组织呈粉末或豆渣样；是否蜡片中央出现空洞、缺 损；

这两种现象分别为脱水过度及脱水不足的表现。切好的切片放入60℃烤箱烤片1ｈ。

1.2.5 染 色 烤箱中取出烤好蜡的切片→二甲苯5min→二甲苯Ⅱ5min→无水酒精5min→无水酒精Ⅱ 5min→95%酒精 5min→80%酒精 5min→70% 酒精 5min→流 水10s→苏木素 8min→流水冲洗 2min→3%盐酸酒精分化 1s→流 水 反蓝 30min→伊 8min→70%酒 精 10s→ 80%酒精 10s→95%酒精 10s→无水酒精 10s→无水酒精 10s→二甲Ⅰ5min→二甲苯Ⅱ5min→中性树 脂封片→j显微镜下观察切片质量。

以上实验重复五次。

2结果

切片质量判定标准

"+++" 表示切片效果极好，蜡片厚薄均匀，展片良好，组织形态完整，染色对比清晰。

"++" 表示切片效果较好，蜡片有轻度裂痕，展片良好，组织形态较完整，染色对比较清晰。

"+" 表示切片效果尚可，蜡片有较多裂痕，展片较好，组织形态还算完整，染色对比较清晰。

"+ -" 表示切片效果一般，蜡片出现破碎，组织中央出现空洞，展片出现散片现象，组织形态欠完整，染色对比欠清晰。

"-" 表示切片效果差，组织中央松软空洞无法切下或破碎成粉末状，组织形态结构完全破碎。

表1 实验组和脱水时间段（min）及最终切片效果

实验分组	大脑	肺脏	肝脏	脾脏	心脏	肾脏	皮肤
第一组（30min）	+++	+++	+	+	+-	+-	-
第二组(40min)	++	++	+++	+++	+	+	-
第三组(50min)	+	+	+	+	+++	+++	+-
第四组(60min)	+-	+-	+-	+-	++	+	+
第五组(75min)	-	-	-	-	+-	+-	+++

结果表明：在 室温下，小白鼠组织块的最 佳脱水时间是在浓度梯度分别 60 %、75 %、80%、95 %Ⅰ、95 %Ⅱ的 各级乙醇中脑、肺为30min，肝、脾为 40min，心、肾 60 min，皮肤为75min，在浓度 100 %Ⅰ、100 %Ⅱ乙醇中各 30 min。透明的最佳时间：脑、肺在二甲苯Ⅰ和Ⅱ中各20min,肝、脾在二甲苯Ⅰ和Ⅱ中各30min，心、肾在二甲苯Ⅰ和Ⅱ中各40min，皮肤在二甲苯Ⅰ和Ⅱ中50min。

3讨论

小白鼠因为其组织结构柔软细小含水量多，纤维组织较少，所以使用常规方法制作的切片往往达不到很好的效果，且其每种组织器官质地不同含水量不同，处理时需要的时间也不尽相同，因此我们在石蜡切片制作过程的关键步骤--脱水透明和浸蜡处理时间上进行反复实践和摸索，得到每种组织器官最好的脱水透明效果取以利于切片顺利进行，按本实验得出的各组织器官最佳脱水透明时间所制备小白鼠组织切片蜡带连续，切片平整均匀，经HE染色后观察组织形态完整，染色对比鲜明，很好的满足科研工作的需要。

参考文献

[1] 刘育艳. 制作优质实验动物组织切片的有效方法 [J]. 山西医科大 学学报, 2001, 32(3): 275-276

[2]王伟 赵灿灿等 18℃恒温下,石蜡切片制作过程的脱水透明最佳时间探索 [J].现代生物医学进展，2013,13（7）：1236-1239

作者简介 ：周剑莉 (1977一)，女 ，江 西省吉安市人 ，学士。实验师 ，从事形态学实验教学工作 。