三聚氰胺分子印迹表面等离子体共振传感器的制备及分析应用

常颖

河南能源化工集团中原大化有限责任公司 河南省 450000

摘要：三聚氰胺作为一种化工原料常被添加到塑料、纤维和胶水中以提高产品性能。但近年来，有人将其非法添加于乳制品中以提高表观蛋白质含量．这是因为三聚氰胺分子中含氮量高达66％，然而，三聚氰胺可对人体带来严重的危害导致生殖及泌尿系统的损害，甚至可诱发膀胱癌。因此研究快捷、灵敏的乳制品中三聚氰胺检测方法，具有重要的食品卫生学意义．分子印迹电化学传感技术，方法简单、灵敏、特异性好，日益受到分析工作者的关注。

关键词：三聚氰胺分子印迹表面等离子体共振传感器；制备；应用；

前言：三聚氰胺MM是一种重要的三嗪类含氮杂环有机化合物,可用于生产三聚氰胺-甲醛树脂,被广泛应用于塑料、涂料、木材加工、造纸、皮革以及电气等行业。MM 分子中含氮量达到66. 7％,因而会被不法商家用于食品和饲料中,以提高产品中的氮含量。美国食物及药物管理局标准规定,MM 每日最大摄入量为0. 63 mg／ (kg·bw) 。国家卫生部2011 年第10 号公告“关于三聚氰胺在食品中的限量值的公告(2011 年第10 号)”中规定,婴儿配方食品中三聚氰胺的限量值为1 mg／ kg,其它食品中三聚氰胺的限量值为2. 5 mg／kg 。长期摄入MM 会导致肾结石,甚至诱发膀胱癌或肾衰竭[3,4] 。因此,食品中MM 的检测引起了极大的关注。

一、实验部分

1．实验材料和仪器。三聚氰胺，乙腈，含0．1 mol／L KCl、5 mmol／L K3 Fe(CN)6为测试背景溶液．Autolab电化学工作站；电化学实验用三电极体系：玻碳电极(GCE)或修饰电极为工作电极，Ag／AgCl(3MKCl)为参比电极，铂片电极为对电极；场发射扫描电镜；超声清洗仪；PHS．3D型酸度计；Synergy超纯水系统。

2.玻碳电极的预处理。玻碳电极依次经0．309m和0．059m的a．A203抛光粉悬浊液抛光后，分别用无水乙醇和去离子水超声清洗2 min，将电极放入0．1 mol／L KCl和5 mmol／L K3[Fe(CN)的混合溶液中于一0．1-0．6V范围内进行循环伏安扫描至稳定，取出用超纯水淋洗待用。

3.三聚氰胺分子印迹电化学传感器工作电极的制备。玻碳电极为工作电极，邻氨基酚为功能单体，将0．0327 g邻氨基酚溶于5 mL PBS缓冲溶液中，用1 mol／L的NaOH溶液调pH值为弱酸性，加入1 g／L三聚氰胺水溶液2 mL，用乙腈定容至10 mL，制成自组装溶液．超声3 min除02，保持电解池密闭遮光，然后浸入三电极系统，在室温下静置30min，在一0．3～1．2V电位范围内，在自组装溶液中，以50mV／s的扫描速率扫描30圈，然后取出工作电极，再将其在乙酸、甲醇、乙腈混合溶液(体积比3：4：4)中浸泡一定时间以洗脱三聚氰胺印迹分子，便制得三聚氰胺印迹电极．采用同样的方法制备不加三聚氰胺印迹分子的对照非印迹电极.

4.传感器的电化学分析检测方法。以含0．1 mol／L KCl和5 mmol／L K3[Fe(CN)混合溶液为检测背景溶液，将印迹电极置于含背景溶液的待测液中富集5 min，于一0．1-0．6V电位范围内，以50 mV／s的扫描速率进行循环伏安扫描；在电位范围一0．1～O．6 V，电位增量0．005 V，振幅0．05 V，脉冲宽度0．1 S，采样宽度0．02 S的条件下，进行差分脉冲(DPV)扫描．每次测试完用超纯水淋洗。

二、讨论分析应用

1. 分子印迹过程及电化学聚合扫描圈数的影响。在缓冲溶液中，OAP中功能基团一NH和一OH易与三聚氰胺分子中的N原子形成氢键；电聚合过程中，三聚氰胺分子通过氢键作用进入邻氨基酚聚合膜(POAP)中；洗脱时，氢键被破坏，印迹分子溶解于洗脱液中的甲醇与乙酸被洗脱下来，三聚氰胺分子从POAP空穴中逸出，形成分子印迹空穴；测定时，三聚氰胺分子又可通过氢键作用再进入分子印迹膜中，使得分子印迹空穴封闭．以K3[Fe(CN)为电化学活性探针分子，印迹空穴封闭后，可引起K3[Fe(CN)响应电流的变化，从而可间接检测三聚氰胺分子．在三聚氰胺印迹分子存在下，利用循环伏安法电聚合邻氨基酚，在玻碳电极上形成一种棕红色的聚合膜。沉积在玻碳电极表面的聚邻氨基酚膜的厚度对电化学传感的敏感性有较大影响。膜太厚则包埋在膜中的印迹分子不易洗脱出来，而膜太薄则形成的“位点”太少，不能有效的重新键合固定模板分子，因此可通过扫描的圈数来控制膜厚度。

2．OAP单体浓度及与三聚氰胺浓度配比的影响。OAP单体与三聚氰胺印迹分子的浓度比对印迹膜性能有影响．实验中电聚合时固定三聚氰胺的浓度为1．5 mmol／L，分别使OAP与三聚氰胺的浓度比为10：1、20：1和30：l，制备了不同的三聚氰胺分子印迹膜电极，印迹分子洗脱后，采用DPV法在背景溶液中检测印迹电极响应性能．当OAP与三聚氰胺浓度比为20：1时，制备的印迹膜具有较大的响应，故实验中采用的二者的浓度比为20：1。背景溶液pH值6．80时，电极响应越最大，因此本实验选择白组装溶液和背景溶液的pH值均为6．80．

3.洗脱溶剂的选择及洗脱时间的影响。分别采用硫酸和甲醇，硫酸、甲醇和乙腈，乙酸和甲醇，乙腈、甲醇和乙酸混合溶剂作为洗脱溶剂，以同样的方法洗脱相同时间，然后进行测试．结果表明：乙腈、甲醇和乙酸(体积比为4：4：3)混合溶液作为洗脱剂时，洗脱效果最佳，电极响应信号最大．采用该混合溶剂作为洗脱溶剂对制备的三聚氰胺分子印迹电极进行洗脱时间实验，每隔1h进行检测洗脱时间为24h时印迹电极的电化学响应越达到最大．继续延长洗脱时间会略有下降，因此，本实验选择洗脱时问为24h。

4.分子印迹验证。对裸玻碳电极、印迹敏感膜电极以及非印迹敏感膜电极，在5 mmol／L的K3Fe(CN)6测试溶液中进行CV扫描，验证分子印迹效应结果Fe(CN)63-在裸玻碳电极、印迹敏感膜电极上，均有一对明显的氧化还原峰(见曲线a、b)，但印迹敏感膜电极上得到的峰电流明显要小．这是因为聚合膜致密的表面结构阻碍Fe(CN)。向电极表面扩散，Fe(CN)。只能通过印迹空穴扩散到电极表面进行氧化还原反应．而在非印迹敏感膜电极上无氧化还原峰出现传感器的响应时间、选择性和重现性加入三聚氰胺后，K3[Fe(CN)6]的峰电流逐渐降低，5min内趋于稳定，表明三聚氰胺印迹传感器具有较快的响应时间．采用DPV法，对常见生物碱基及阴阳离子等做选择性实验．定义选择因子为印迹传感电极对干扰物质产生的相对峰电流变化，越为此电极对1．0昭／kg三聚氰胺产生的相对峰电流变化，以K值小于0．10为不干扰三聚氰胺的测定．结果表明，10倍的三聚氰酸、100倍的腺嘌呤、鸟嘌呤、抗坏血酸、葡萄糖、Na+、将使用过的传感器在洗脱液溶液中超声清洗3 min，用超纯水淋洗过后可使传感器基本恢复到响应前的状态．应用该传感器，采用差分脉冲法，在三聚氰胺浓度为10 gg／kg时，为评价三聚氰胺分子印迹聚合物对目标分子的吸附能力,在最佳pH 值条件下测定了MIP 和NIP传感芯片的性能。由波数位移随浓度的增大而升高,当浓度大于3. 0 μmol／ L 后,波数位移不再变化,说明此时吸附达到饱和。因为食品基质复杂,且MM 在食品中含量低,所以大多数方法的前处理过程比较繁琐,常需进行样品富集,耗时费力。近年来,表面等离子体共振技术(SPR)由于具有简易、快速、无标记及灵敏度高等特性而备受关注,SPR 传感器在生命科学领域已得到广泛应用。然而SPR 传感器常需要采用昂贵且不稳定的配体分子如抗原或受体, 识别目标分子,这一不足可通过设计一些耗费低且具有稳定的识别位点的探针等方法克服 。分子印迹技术能提供特异性结合位点 ,而且印迹聚合物具有很高的化学稳定性,成本低,制备简单,可循环利用 。因此,结合SPR 和分子印迹技术的优点,可有效提高目标物的检测灵敏度和选择性

结束语：了三聚氰胺分子印迹SPR 传感器,用于牛奶和奶粉样品中MM 的检测,与国标方法相比,本方法具有较高的选择性和灵敏度,可用于复杂样品中MM 的分析。

参考文献：

[1] 杨盛林，黄思玲．三聚氰胺的性质、检测方法及毒理学[J]．食品与药品，2018，10(ii)：66—69．

[2] 田玉平，王东辉，郭卫荣．乳及乳制品中三聚氰胺的检测方法[J]．化学世界，2019(8)：467—471．

[3] 李秀琴，张庆合，全灿，等．液相色谱一质谱／质谱法对多种基体中三聚氰胺的检测[J]．分析测试学报，2019，28(11)：1260—1265．