阿莫西林颗粒水介质溶出曲线测定方法研究

陈河轺 陈小倩

海口奇力制药股份有限公司 570000

摘 要

目的：建立阿莫西林颗粒溶出曲线测定方法，并进行方法学验证，用于一致性评价样品水介质溶出曲线测定；方法：以十八烷基硅烷皱键合硅胶为填充剂，流动相为0.05mol/L磷酸二氢钾溶液（用2mol/L氢氧化钾溶液调节pH值至5.0）-乙腈（97.5:2.5），检测波长254nm，流速1.0ml/min,进样量：50µl。结果：本法在28.0µg/ml～279.5µg/ml浓度范围内线性良好，相关系数R²值达0.9999；精密度试验阿莫西林主成分保留时间和峰面积保留时间RSD值均小于1.0%；准确度试验平均回收率100.7%；专属性试验阿莫西林主峰保留时间处无辅料及溶剂峰；溶液稳定性试验表明本品溶液在24h内稳定。结论：本方法具有专属性强、精密度、准确度高，溶液稳定性好的特点，且操作简单迅速，适用于阿莫西林颗粒水介质溶出曲线测定。

关键词：阿莫西林颗粒；溶出曲线；高效液相色谱法；方法学验证；

阿莫西林颗粒为抗感染药品，用于敏感菌所致的溶血链球菌、肺炎链球菌、葡萄球菌或流感嗜血杆菌所致中耳炎、鼻窦炎、咽炎、扁桃体炎等上呼吸道感染等的治疗^【1】。海口奇力制药于2003年1月29日彷制获批，批准文号为国药准字H46020584。按国务院办公厅关于开展仿制药质量与疗效一致性评价的意见^【2】的要求，本品需开展与原研或参比制剂一致性评价相关工作，根据普通口服制剂参比制剂选择与确定指导原则^【3】确定本品参比制剂为日本LTL制药株式会社生产的阿莫西林细粒剂（规格为100mg︰1g），本文探讨口服制剂一致性评价关键指标之一水介质溶出曲线检测方法的建立及验证，评价该方法的适用性。

一、材料与试剂

1.1、仪器

岛津LC-2030CHT高效液相色谱仪（配备紫外检测器）；奥豪斯EX125DZH型十万分之一电子天平；上海康仪PHS-3酸度计。

1.2、试剂

乙腈（色谱纯） 规格：4L 来源：TEDIA；

磷酸二氢钾（分析纯） 规格：500g 来源：广州化学试剂厂；

氢氧化钾（分析纯）规格：500g 来源：广州化学试剂厂；

1.3、供试品

彷制制剂：阿莫西林颗粒，批号为2005001、2005002、2005003，均为海口奇力制药股份有限公司生产。

参比制剂：阿莫西林细粒 批号为2008A02，日本LTL制药株式会社生产。

1.4、对照品

阿莫西林工作对照品，根据中检院对照品自行标定，批号为20201014，含量：87.2%。

二、实验方法

2.1、色谱条件

采用COSMOSIL 5C18-PAQ (4.6×150mm，5μm)色谱柱；流动相为0.05mol/L磷酸二氢钾溶液（用2mol/L氢氧化钾溶液调节pH值至5.0）-乙腈（97.5:2.5），柱温：室温，检测波长254nm，流速1.0ml/min,进样量：50µl。

2.2、溶液配制

系统适用性溶液：同对照品溶液。

对照品溶液的制备：取阿莫西林对照品适量，精密称定，加溶出介质适量超声使溶解，用溶出介质定量稀释制成每1ml中约含140µg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取本品1袋（规格0.125g），照溶出度与释放度测定法（中国药典2020年版四部通则0931第二法），以水900ml为溶出介质，转速为每分钟50转，依法操作，经5、10、15、30、60分钟时，取溶液10ml（同时补加相同温度相同体积的溶出介质），滤过（至少弃去初滤液3ml），取续滤液即得。

2.3、测定法

照《中国药典》2020年版四部通则高效液相色谱法^【4】,精密量取系统适用性溶液50µl注入高效液相色谱仪，重复进样5次，峰面积RSD应小于2.0%,再分别精密量取对照品溶液、各取样点供试品溶液50µl，依次注入高效液相色谱仪，等度洗脱，记录色谱图，按外标法以峰面积计算供试品中阿莫西林溶出量。

三、实验结果

3.1、方法的建立

本法引用自中国药典2020年版二部阿莫西林原料含量测定方法，由于阿莫西林颗粒加入了蔗糖、糊精、香兰素等辅料，需要进行方法学验证，检查方法的适用性。

3.2、方法学验证结果

3.2.1、线性与范围

取阿莫西林对照品适量，精密称定，加水定量稀释制成含阿莫西林浓度分别为28.0µg/ml、83.9µg/ml、111.8µg/ml、139.8µg/ml、195.7µg/ml、279.5µg/ml、的系列对照品溶液，按照以上确定的色谱条件，分别进样50µl，峰面积分别为247907、729829、959935、1202967、1663236、2365766，以阿莫西林的浓度（µg/ml）为横坐标，峰面积为纵坐标，将峰面积与对应浓度值做直线回归，求得直线回归方程为y=8402.8x+20532，其相关系数R²=0.9999。结果表明，阿莫西林浓度在28.0～279.5µg/ml范围内线性关系良好。线性关系图见下图1。

图1标准曲线图

3.2.2、精密度试验

取“3.2.1线性与范围”项下“线性供试品溶液（1）、（4）、（6）”分别作为20%、100%、200%精密度试验溶液，精密量取上述溶液各50µl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。各溶液均连续进样6次，计算主成分保留时间和峰面积的RSD值。阿莫西林保留时间RSD值均小于1.0%，峰面积RSD值均小于2.0%，说明本法精密度良好。试验结果见下表1

表1 精密度试验

名称 次数	20%浓度		100%浓度		200%浓度
	RT（min）	A	RT（min）	A	RT（min）	A
1	4.820	247110	4.834	1202085	4.850	2364204
2	4.821	247190	4.834	1202775	4.850	2363163
3	4.820	246994	4.832	1201866	4.850	2363370
4	4.820	247091	4.834	1201942	4.851	2362554
5	4.819	246980	4.833	1201966	4.850	2363057
6	4.821	247019	4.834	1202064	4.851	2361624
均值	4.82017	247064.000	4.833500	1202116.333	4.85033	2362995.333
RSD（%）	0.02%	0.03%	0.02%	0.03%	0.01%	0.04%

3.2.3、准确度试验

对照品溶液：取阿莫西林对照品约16mg，精密称定，置100ml量瓶中，加水适量，超声使溶解，并用水稀释至刻度，摇匀，即得。

空白辅料溶液：称取蔗糖54.5g，糊精0.625g，枸椽酸钠31.25mg，日落黄铝色淀30mg，香兰素6.25mg，草莓味香精62.5mg，桔子味香精62.5mg，置250ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置10 ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。

供试品溶液（70%浓度）：取阿莫西林对照品约11.2mg，精密称定，置100ml量瓶中，同时加入处方量的空白辅料溶液1ml，加水适量，超声使溶解并用水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得70%浓度回收率供试品溶液。平行配制3份。

供试品溶液（100%浓度）：取阿莫西林对照品约16mg，精密称定，置100ml量瓶中，同时加入处方量的空白辅料溶液1ml，加水适量，超声使溶解并用水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得100%浓度回收率供试品溶液。平行配制3份。

供试品溶液（120%浓度）：取阿莫西林对照品约19.2mg，精密称定，置100ml量瓶中，同时加入处方量的空白辅料溶液1ml，加水适量，超声使溶解并用水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得120%浓度回收率供试品溶液。平行配制3份。

精密量取上述溶液各50µl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算。

试验结果表明：水介质各浓度下平均回收率均在98.0%~102.0%之间，9份样品回收率RSD值均小于2.0%，符合验证要求，说明本法准确度良好，具体结果见下表2。

表2 回收率试验结果

浓度	投入量（mg）	测得量（mg）	回收率（%）	平均回收率（%）	平均回收率（%）	RSD （%）
70%	10.05	10.15	100.9	100.8	100.7	0.24
	10.19	10.25	100.6
	10.09	10.17	100.8
100%	14.41	14.47	100.4	100.6
	14.56	14.67	100.7
	14.73	14.81	100.6
120%	16.99	17.18	101.1	100.8
	17.01	17.09	100.5
	17.06	17.22	101.0

3.2.4、专属性试验

按本品制剂处方配制无阿莫西林的空白辅料溶液及空白溶剂（稀释剂），依法测定，与供试品溶液图谱比较。试验结果表明供试品阿莫西林保留时间约为4.8min，而空白辅料溶液在主峰附近数分钟范围内均无吸收峰，说明阿莫西林颗粒辅料中不含有干扰主成分检测的物质，方法专属性良好。

图2供试品溶液图谱

图3空白辅料图谱

图4空白溶剂图谱

3.2.5、溶液稳定性试验

供试品溶液：取阿莫西林颗粒约145mg，精密称定，置100ml量瓶中，加水适量，超声处理5min，用水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

将上述供试品溶液于低温（4℃）下放置24小时，分别于放置的第0h、2h、4h、6h、8h、12h、18h、24h时，精密量取50µl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。

试验结果表明：在水介质中，供试品溶液低温（4℃）下放置24h，峰面积RSD值＜2.0%，溶液稳定，具体结果详见下表3。

表3 溶液稳定性试验结果

时间（h）	主峰面积
0	1228048
2	1226819
4	1225235
6	1223534
8	1221253
12	1220131
18	1218672
24	1218235
均值	1216571.9
RSD（%）	0.31

3.3、阿莫西林颗粒样品水介质溶出曲线测定结果

按本法检测2005001、2005002、2005003批阿莫西林颗粒成品样品水介质溶出曲线，并与参比制剂结果进行比较，溶出曲线相似因子f2值分别为81、79、83，均大于50，符合溶出曲线相似性要求。

四、结论

中国药典2020年版二部阿莫西林颗粒制剂质量标准中无溶出度或溶出曲线项目，因一致性评价工作需要，采用药典收载的阿莫西林原料含量测方法，进样量变更为50µl，操作简便、用时短、结果准确，方法学验证结果表：线性试验相关系数R²达值0.9999，精密度试验阿莫西林主成分保留时间和峰面积保留时间RSD值均小于1.0%；准确度试验平均回收率100.7%；专属性试验阿莫西林主峰保留时间处无辅料及溶剂峰；溶液稳定性试验表明本品溶液在24h内稳定。各项方法学验证结果良好，本法适用于阿莫西林颗粒水介质溶出曲线的测定。

参考文献

[1] www.baidu.com百度百科 阿莫西林

[2] 国发办〔2016〕8号“国务院办公厅关于开展仿制药质量与疗效一致性评价的意见”

[3] 普通口服固体制剂参比制剂选择和确定指导原则2016-03-18

[4] 国家药典委员会 中国药典2020年版四部 通则0512高效液相色谱法