蒙药山沉香保护心肌细胞氧化损伤研究

红艳，李聪明，辛颖

内蒙古民族大学 蒙医药学院，内蒙古 通辽， 028000

摘要 目的：研究蒙药山沉香体外抗H₂O₂致H9c2细胞氧化损伤的保护作用。方法：在H9c2细胞上进行细胞毒性实验，确定山沉香的最大安全浓度；以H₂O₂致H9c2细胞氧化损伤为模型，观察山沉香对心肌细胞损伤的保护作用，从抗氧化角度探讨山沉香对心肌细胞的保护作用。结果： MTT实验结果表明，山沉香在细胞上的最大安全浓度是4mg/mL，随着药物浓度的增加出现对细胞增殖的抑制作用。在安全浓度下，山沉香均表现出不同程度的对H₂O₂致H9c2细胞氧化损伤的保护作用，可明显降低MDA、LDH的水平，增加SOD的活性。结论：蒙药山沉香可通过抗氧化以发挥保护心肌细胞损伤的作用。

关键词：蒙药；山沉香；心肌细胞；氧化损伤

心血管疾病是全球造成死亡的最主要原因，由于人口的快速增长预计在2002 年至2030年，年均每百万人口因心血管疾病的死亡率将从16.7人增加到23.3人。缺血性心脏病，特别是心肌梗死（ Myocardial Infarction，MI）是导致心力衰竭和致死的重要原因之一^[1]。MI是冠状动脉闭塞导致血流中断，使部分心肌因严重的持久性缺血发生局部坏死，坏死的心肌被纤维化瘢痕组织代替，失去了原有的收缩功能，逐步发展为心律失常、休克或心力衰竭，严重可致死亡^[2,3]。目前MI引起的心肌损伤被公认为是心肌缺血再灌注（ischemia / reperfusion，I/R）损伤^[4-6]，I/R损伤的机制涉及中性粒细胞浸润、钙超载、能量代谢障碍等多种学说，其中氧化应激学说是当前研究热点^[7,8]。

山沉香（Syringa pinnatifolia Hemsl .）为木犀科丁香属植物，别名贺兰山丁香。在内蒙古地区，人们将山沉香作为名贵中药沉香的替代品，具有悠久的应用历史，主要用于治疗心绞痛、心热、头晕、失眠、心悸、气喘、“赫依”病,具有良好的治疗效果^[9,10]。

本研究建立H₂O₂诱导的体外心肌细胞氧化应激损伤模型，研究山沉香是否可以抑制H₂O₂对心肌细胞的损伤作用，为山沉香防治心血管疾病的药效物质基础研究提供实验依据。

1. 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 主要仪器

SW-CJ-2FD超净工作台（苏州）；Forma 3111 CO2培养箱（美国Thermo Scientific）；TS100-F倒置显微镜（日本尼康）；DNM-9602 酶标仪（北京）；cobas c 311型全自动生化仪（南京）；UV756CRT 分光光度计（上海）；YC-1 层析柜（北京）；RH-2050低温冷冻离心机（湘仪）；TDL-5-A低速离心机（上海）； DWJ2-10L-Z型超纯水机（重庆）；HH-S260s型数显恒温水浴锅（金坛）。

1.1.2 试剂与药品

山沉香药材于2020年8月采集于贺兰山，经内蒙古民族大学蒙医药学院徐都冷教授鉴定为木犀科丁香属植物山沉香（Syringa pinnatifolia Hemsl .）的去皮枝干；H₂O₂：美国，Sigma公司；乳酸脱氢酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）试剂盒：上海源叶生物有限公司；MTT：美国，Sigma公司；胎牛血清（FBS）：美国，Gibco公司；胰酶：美国，Sigma公司；DMEM培养基：美国，Gibco公司；二甲基亚砜（DMSO），天津科密欧公司。

1 .2 实验方法

1.2.1心肌细胞的培养

H9c2细胞在含有10% 胎牛血清的DMEM培养基中，37℃、5%CO₂条件下培养。培养至细胞达到85% - 90%时，用0.08%胰酶消化细胞，细胞（1.0×10⁵个/mL）接种于96孔板或者6孔板中继续培养。

1.2.2 山沉香的制备及细胞毒性测定

用DMSO 作为溶剂，将山沉香粉末稀释成为最大浓度，过滤除菌后备用。使用DMEM培养基将山沉香药液倍比稀释，每组设8个复孔，继续培养24h后，每孔加入50μL MTT（1mg·mL^-1)，4h后吸弃上清液，加入100μL DMSO，振荡混匀后用酶标仪在490nm波长下测定OD值。统计学分析后确定实验中山沉香对细胞的最大安全浓度。

1.2.3 山沉香对心肌细胞损伤的保护作用

将培养48 h的H9c2接种到6孔板中，分为正常对照组、H₂O₂组（终浓度为100µM）、山沉香保护组（终浓度分别为1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL），设3个复孔。继续培养24h，按试剂盒说明检测细胞培养液中LDH、SOD和MDA相关指标的水平。

1.2.4统计学方法

数据用平均值± 标准差表示，采用SPSS22.0统计软件对各组数据进行统计处理和组间比较。

2. 结果

2.1 山沉香的细胞毒性

使用DMEM培养基将山沉香（DMSO为溶剂）药物溶液倍比稀释后，制成12.0mg/mL为最大浓度，稀释的各浓度梯度（0.1-12mg/mL），在H9c2细胞24h后，使用MTT法测定各浓度的细胞毒性，最终得出4mg/mL为山沉香在细胞上的最大安全浓度。结果见表1。

表1 山沉香在细胞上的最大安全浓度

组别	浓度（mg/mL）	OD值
空白组	—	0.95±0.12
山沉香组	0.1	0.98±0.08
	0.5	0.97±0.11
	1.0	0.95±0.17
	2.0	0.96±0.09
	4.0	0.91±0.12
	6.0	0.76±0.05﹡
	8.0	0.68±0.08﹡
	10.0	0.55±0.04﹡
	12.0	0.45±0.09﹡

注：与空白组比较，^﹡P<0.05

2.2 6山沉香对H₂O₂致H9c2细胞损伤的保护作用

与正常对照组比较，H₂O₂对H9c2细胞有明显的损伤作用, 表现为SOD明显低于正常对照组（P <0.05）；LDH、CK的活性明显高于正常对照组（P <0.05）；MDA含量明显高于正常对照组（P <0.05）。山沉香对H₂O₂引起的损伤明显具有保护作用，浓度为2、4mg/mL时，可以明显升高细胞上清液中的LDH和SOD水平，降低MDA含量。提示山沉香可能通过抑制脂质过氧化反应和清除自由基产生而产生保护心肌细胞氧化损伤的作用。结果见表2。

表2 山沉香对H₂O₂致H9c2细胞损伤的保护作用

组别	浓度（mg/mL）	LDH（kU/L）	SOD（U·mL-1）	MDA（µmol/L）
空白组	—	1.03±0.02	0.64±0.07	3.02±0.31
H2O2组	100	3.98±0.06﹡﹡	0.38±0.08﹡	13.82±3.17﹡﹡
山沉香组	1.0	3.21±0.08	0.39±0.06	13.73±1.09
	2.0	1.74±0.08﹟	0.54±0.07﹟	5.48±0.54﹟﹟
	4.0	1.28±0.07﹟﹟	0.59±0.01﹟	4.12±0.61﹟﹟

注：与空白组比较，^﹡P<0.05，^﹡﹡P<0.01；与H₂O₂组比较，^﹟P<0.05，^﹟﹟P<0.01

3. 讨论

心肌细胞培养作为一种体外研究模型，已成为从细胞和分子水平研究心血管疾病发病机理以及有效药物筛选的基本方法和手段之一。H9c2细胞株是源于BDIX大鼠胚胎心脏组织克隆出的亚细胞株，具有心肌细胞的形态结构与功能，比原代乳鼠心肌细胞更易于培养和传代。本研究用H₂O₂造成H9c2细胞的氧化应激损伤模型，旨在对比观察山沉香的心肌保护作用。LDH、SOD和MDA是心肌细胞损伤常用的检测指标，心肌损伤或坏死时经常伴随上述指标的变化。本实验分别从自由基、脂质过氧化产物、抗氧化酶和心肌酶等不同角度选取了具有代表性的检测指标，观察山沉香对心肌细胞的保护作用^[11]。

本研究中，H₂O₂造成H9c2细胞的氧化应激损伤模型中，LDH、MDA含量升高，SOD水平降低，表明氧化应激损伤模型的建立成功；而山沉香干预后能够升高细胞上清液中的SOD水平，降低LDH、MDA含量。提示山沉香可能通过抑制脂质过氧化反应和清除自由基产生而产生保护心肌细胞氧化损伤的作用。

参考文献

[1] O’Gara PT, Kushner FG, Ascheim DD, et al. 2013 ACCF/AHA guideline for the management of ST-elevation myocardial infarction: executive summary: a report of the American College of Cardiology Foundation/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines. J Am Coll Cardiol 2013, 61: 485-510.

[3] Eapen ZJ, Tang WH, Felker GM, et al. Defining heart failure end points in ST-segment elevation myocardial infarction trials: integrating past experiences to chart a path forward. Circ Cardiovasc Qual Outcomes 2012, 5: 594-600.

[4] Sinnaeve PR, Armstrong PW, Gershlick AH, et al. STEMI patients randomized to a pharmacoinvasive strategy or primary PCI: the STREAM 1-year mortality follow-up. Circulation 2014, 130:1139-1145.

[5] Yellon DM, Hausenloy DJ. Myocardial reperfusion injury. N Engl J Med 2007, 357: 1121-1135.

[6] Piper HM, Meuter K, Schäfer C. Cellular mechanisms of ischemia-reperfusion injury. Ann Thorac Surg 2003, 75: S644–648.

[7] Chouchani ET, Pell VR, Gaude E, et al. Ischaemic accumulation of succinate controls reperfusion injury through mitochondrial ROS. Nature, 2014, 515: 431-435.

[8] Parinandi NL, Zwizinski CW, Schmid HH. Free radical-induced alterations of myocardial membrane proteins. Arch. Biochem. Biophys, 1991, 289: 118-123.

[9] 国家中医药管理局中华本草编委会. 中华本草·蒙药卷. 上海：上海科学出版社，2002：173.

[10] 苏国柱，陈洁，曹愿，等. 蒙药山沉香的化学成分和药理活性研究进展[J]. 中国中药杂志，2015，40（22）：4333-4338.

[11] 邢蕾蕾，胡晓慧，杨瑾，艾乐，王怡，王炎炎. 甘草对H₂O₂诱导大鼠H9c2心肌细胞损伤保护作用的研究[J]. 天津中医药大学学报，2017，36（6）：455-460.

作者简介：红艳，副教授，从事蒙药鉴定与资源可持续利用研究，E-mail：[e-mail]

项目来源：国家重点研发计划资助（2019YFC1712300）；内蒙古自治区高等学校科学研究项目（NJZY19158）