冬虫夏草人工繁育的研究

王咏琦

杭州中美华东制药江东有限公司 浙江 杭州 310 000

摘要：冬虫夏草为麦角菌科真菌冬虫夏草菌(Cordycepssinensis(BerK．)Sacc．)寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座和幼虫尸体的干燥复合体。补肾益肺,止血化痰。用于肾虚精亏,阳痿遗精,腰膝酸痛,久咳虚喘,劳嗽咯血。天然冬虫夏草的生长条件极其特殊,加之全球气候变化、生态环境破坏,以及掠夺式的采挖,导致冬虫夏草的野生资源日趋减少,药源紧缺。自２０世纪７０年代开始,冬虫夏草人工繁育研究一直是中药资源保护、再生领域的热点课题。

关键词：冬虫夏草;冬虫夏草菌;人工繁育

一、冬虫夏草菌分生孢子

菌种繁育一直是冬虫夏草人工培育产业化的关键,是实现冬虫夏草产业化的前提。目前冬虫夏草菌种繁育主要方式有两种：一是冬虫夏草有性繁育,通过采收成熟子实体,收集到子囊孢子，再通过微循环产孢获取分生孢子菌种用于蝙蝠蛾幼虫的侵染。但此种方式成本较高、菌种纯度低,菌种侵染力不稳定,侵染率高时可达到９０％以上,低的仅有３０％,导致菌种制剂质量难于控制;二是通过采集野外的新鲜冬虫夏草进行组织分离、纯化后得到冬虫夏草菌株，将该菌株经过无性培养获得具有侵染力的分生孢子菌种。此种方式具有成本低廉,菌株纯度高,分生孢子侵染力较稳定,便于菌种制剂制备等优势。

我国经多年研究已证明中国被毛孢(Hirsutellahepiali)是冬虫夏草菌真正的无性型。其最适培养温度为１５~２０℃,适宜pH值为５. ０~６. ０。在固体培养基培养条件下,中国被毛孢的次级菌丝可以形成分生孢子梗,其顶端膨胀分裂后形成分生孢子。中国被毛孢在适宜条件下培养可产生无色和近黑色两种颜色的分生孢子,形态有肾形、椭圆形、长椭圆形和近球形等多种形态,大小为１．３６~１３．７６μm×１．０３~９．１８μm。中国被毛孢菌株不同菌株的产孢能力存在差异,比较了５株中国被毛孢菌株在不同培养条件下的产孢率,无论固体培养还是液体培养,５株菌株的产孢率均存在差异,筛选出产孢率较高的中国被毛孢菌株７B和８B。此外,冬虫夏草不同部位来源的菌株产孢能力也存在差异,吕延华在泥炭土培养基中试验,发现子座菌株产孢能力优于虫体菌株。

除中国被毛孢菌株自身生长特性外,不同培养条件、营养条件、培养方式等都对分生孢子的产量具有重要影响。对冬虫夏草真菌在营养、温度及光

照下产生分生孢子的最佳条件进行了筛选,发现在琼脂培养基中加入玉米粉、麦麸或小麦时产生分生孢子较多,温度在１５~１８℃,完全黑暗条件下分生孢子产生较多，研究温度条件和光照条件对冬虫夏草菌分生孢子产量的影响的结论与李玉玲基本一致。还做了以下试验，当处于最佳培养条件为:温度１４℃、pH值５．８０、完全黑暗的环境下时,培养４０d。比较了微量元素和氨基酸对冬虫夏草菌分生孢子产量的影响。实验表明：微量元素中Fe２＋、Zn２＋、Mn２＋均能促进分生孢子的产生,而Cu２＋对其有抑制作用;氨基酸中组氨酸对分生孢子产量的促进作用最强,而蛋氨酸会抑制中国被毛孢孢子的产生。研究添加植物激素对冬虫夏草菌固体发酵产分生孢子能力的影响,发现泥炭土培养基中添加０．１‰吲哚乙酸、０．１‰吲哚丁酸和０．１‰萘乙酸能促进冬虫夏草菌气生菌丝的生长和分生孢子的产生。最佳培养条件为:１８℃培养３０d后,在１０℃、相对湿度４５％、蓝光照射环境中培养。

二、冬虫夏草的人工接种

冬虫夏草的人工繁育主要是通过人工接种冬虫夏草菌以提高蝙蝠蛾幼虫感菌率,再将感菌幼虫在低海拔室内模拟高原环境条件培育或在高海拔冬虫夏草适生地培育,长出子座形成冬虫夏草。人工接种的感染率是冬虫夏草人工繁育的关键参数,为此多位学者对接种方式进行了研究以期提高接种感染率,促进冬虫夏草的形成。将冬虫夏草菌分别用表皮涂布、口器注入、体壁注射和混入饲料等方法进行接菌感染试验,均能成功感染蝙蝠蛾幼虫,以拌入饲料接种法感染率最高。利用实时定量技术检测了寄主蝠蛾幼虫不同组织中冬虫夏草菌定殖量,推论冬虫夏草菌随口腔摄食侵染方式具有可行性。用不同产地冬虫夏草菌进行侵染实验,发现不同产地冬虫夏草菌的侵染力存在差异,其中小金产冬虫夏草菌菌株感染率最高。

三、冬虫夏草人工繁育品评价

冬虫夏草含有多种特殊的活性成分,目前已知成分有糖类、氨基酸类、核苷酸类、酸脂类、无机元素类、维生素等。随着冬虫夏草人工繁育的实现,科研人员相继开展了冬虫夏草人工繁育品活性成分和药理作用的相关研究。发现冬虫夏草人工繁育品药理成分及含量均与野生冬虫夏草基本一致,且重金属及有害元素含量符合国际标准。冬虫夏草人工繁育品具有抗肿瘤、提高免疫力、补肾、益肺等多种药理活性。对冬虫夏草野生品、繁育品进行红外测试。其指纹图谱具有较好的一致性,相似度大于０．９０。采用反相高效液相色谱法测定冬虫夏草人工繁育品与野生冬虫夏草中腺苷的含量，发现无显著性差异。采用超声水提法提取虫草酸,高效液相色谱法检测含量，冬虫夏草繁育品与野生冬虫夏草虫草酸含量差异不显著,具有良好一致性。采用超高效液相色谱法,测定冬虫夏草人工繁育品与野生品的麦角甾醇含量，结果基本一致。采用气相色谱法分析冬虫夏草中脂肪酸和挥发性成分,均含有１８种脂肪酸,主要脂肪酸比例相近；含有９种挥发性成分,挥发性成分组成比例相当。采用氨基酸分析仪测定冬虫夏草人工繁育品、野生品中１７种氨基酸的含量，结果基本一致。采用质谱法测定冬虫夏草人工繁育品的铅、镉、砷、汞、铜含量，结果符合国际标准,汞难以达到检测限。

冬虫夏草繁育品对黑色素瘤细胞、白血病细胞、乳腺癌细胞等多种癌细胞都有抑制作用。能将肿瘤细胞阻滞在G１/S期,从而显著抑制肿瘤细胞的增殖,并通过抑制相关蛋白的表达来降低肿瘤细胞的迁移能力。冬虫夏草繁育品可改善小鼠的肾阳虚症状,对糖尿病肾病大鼠足细胞损伤起保护作用,对炎症因子表达的升高具有显著抑制作用,对不同病因导致的肺部炎症均具有一定的治疗作用。改善给药组小鼠的抗氧化能力、炎症因子水平、体外NO释放和脑组织形态等病理改变起到增强免疫和抗衰老作用。

四、结语

冬虫夏草的人工繁育,有利于弥补冬虫夏草野生资源的不足,满足人们的健康需求。对提高冬虫夏草的质量、规范冬虫夏草市场、保护高原生态环境和资源也具有重要意义。目前冬虫夏草人工繁育仍不成熟,存在产量低、成本高、繁育周期长、寄主蝙蝠蛾生长易遭受病害侵袭等问题。

未来应该在以下几个方面进行重点研究：冬虫夏草菌的选育研究,筛选生长速度快,对蝙蝠蛾幼虫侵染率高的优质菌种,以提高冬虫夏草繁育效率,缩短繁育周期;蝙蝠蛾幼虫的选育研究,提高抗病能力,降低死亡率,降低生产成本;蝙蝠蛾幼虫人工饲料的开发,研发配套的自动化设备,推动冬虫夏草人工繁育的产业升级。在国家政策的扶持及冬虫夏草研究技术的发展下,未来我国冬虫夏草产业必将朝着可持续、健康稳定的方向快速发展。

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